引用本文
吴永富, 米兰, 邹多生, 蔡玉刚, 王燕军. 固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱检测全血、尿液中氟胺酮和去甲氟胺酮[J].刑事技术, 2022,47(5):517-522
WU Yongfu, MI Lan, ZOU Duosheng, CAI Yugang, WANG Yanjun. SLE-HPLC-MS/MS Determining F-ketamine and F-norketamine in Blood or Urine[J]. Forensic Science and Technology,2022,47(5): 517-522  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0135
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固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱检测全血、尿液中氟胺酮和去甲氟胺酮
吴永富1, 米兰2, 邹多生2, 蔡玉刚1,*, 王燕军2,*
1.泸州市公安局刑事科学技术研究所,四川 泸州646000
2.四川省公安厅刑事侦查局,成都610041
* 通信作者简介:蔡玉刚,男,四川遂宁人,学士,高级工程师,研究方向为理化检验。E-mail: 12721703@qq.com;王燕军,男,河北滦南人,硕士,高级工程师,研究方向为法医毒物毒理、微量物证检验。E-mail: 404386715@qq.com

第一作者简介:吴永富,男,河南原阳人,学士,副高级工程师,研究方向为理化检验。E-mail: 277580935@qq.com

收稿日期: 2021-03-19 修回日期: 2021-08-05
基金资助: 四川省省级大学生创新创业训练项目（S202012212005）; 四川省公安厅厅级科研创新项目（2020SCYY01）
摘要

建立固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱（SLE-HPLC-MS/MS）检测全血和尿液中氟胺酮及其代谢物去甲氟胺酮的检验方法。考察液液萃取、固相萃取、固相支撑液液萃取在全血和尿液中对药物的萃取效果,应用液相色谱-串联质谱对全血和尿液中氟胺酮和去甲氟胺酮进行检验分析。结果表明,固相支撑液液萃取法回收率最高,在 0.5~200 ng/mL 范围内全血和尿液中氟胺酮和去甲氟胺酮与峰面积呈现良好的线性关系（ R2大于0.997 2）。全血中的氟胺酮和去甲氟胺酮的最低检出限分别为 0.05和 0.01 ng/mL,尿液中去甲氟胺酮和氟胺酮的最低检出限分别为0.01和0.005 ng/mL。固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱法操作简单、基质效应较小、回收率高,能满足全血和尿液中氟胺酮和去甲氟胺酮的检验需求。

关键词: 法医毒物学; 氟胺酮; 去甲氟胺酮; 固相支撑液液萃取; 高效液相色谱 -串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2022)05-0517-06
SLE-HPLC-MS/MS Determining F-ketamine and F-norketamine in Blood or Urine
WU Yongfu1, MI Lan2, ZOU Duosheng2, CAI Yugang1,*, WANG Yanjun2,*
1. Criminal Science and Technology Institute of Luzhou Public Security Bureau, Luzhou 646000, Sichuan, China
2. Criminal Investigation Division, Sichuan Provincial Public Security Department, Chengdu 610041, China
Abstract

Fluoketamine, a new psychoactive substance from phencyclohexpiperidine, is of anesthetic effect similar to ketamine. Criminals ever took legal loophole to adventruously sell fluoketamine as a substitute for ketamine until the drug has been put into the control list in China. According to the sewage monitoring data relating to drug consumption by law enforcement departments, fluoketamine has already become one most abused drug following to heroin and methamphetamine, and even spread rapidly. Animal experiments have shown that the main metabolite of fluoketamine is norfluoketamine in vivo. In China, there are few reports about the test of in-vivo fluoketamine and norfluoketamine with the exception of testing some in-vitro samples. Thus, the solid supported liquid-liquid extraction (SLE) was here adopted via combination of liquid chromatography/tandem mass spectrometry (SLE-HPLC-MS/MS) to simultaneously detect fluoketamine (F-ketamine) and its metabolite norfluoketamine (F-norketamine) in blood and urine. For the two drugs to be better extracted from blood and urine, a comparison was conducted about the effects of liquid-liquid extraction (LLE), solid-phase extraction (SPE) and solid-phase supported liquid-liquid extraction (SLE), demonstrating SLE was the best. With the extracted F-ketamine and F-norketamine, HPLC-MS/MS was utilized to detect them. Both the F-ketamine and F-norketamine had a good linear relationship to peak area ( R2>0.997 2) when their concentrations ranged among 0.5~200 ng/mL in blood or urine, with their blood delivery as LOD values being respective 0.05 ng/mL and 0.01 ng/mL; contrasting to their urine's as LOD values showing 0.01ng/mL and 0.005ng/mL. The method is of simple operation, low matrix effect and high recovery rate, capable of determining F-ketamine and F-norketamine in blood or urine.

Key words: forensic toxicology; F-ketamine; F-norketamine; SLE; HPLC-MS/MS

氟胺酮[1, 2] （F-ketamine, CAS号111982-49-1）, 系苯环己哌啶类新精神类活性物质, 它具有与氯胺酮类似的分离麻醉作用。由于公安机关加大了对管制类精神药品的打击力度, 不法分子利用氟胺酮尚未列管的法律漏洞, 将其作为氯胺酮的替代品售卖。据执法部门污水毒情监测数据显示[3], 氟胺酮已成为除海洛因和甲基苯丙胺以外滥用最多的毒品, 且迅速蔓延, 引起了相关部门的重视。

通过动物实验发现, 氟胺酮在体内主要代谢产物为去甲氟胺酮。目前国内对体内氟胺酮及去甲氟胺酮检验的相关报道较少, 目前只有谢明清等[4]利用乙腈沉淀蛋白-高效液相色谱-串联质谱对全血中的氟胺酮检验的相关报道, 未对其代谢产物去甲氟胺酮进行检测, 其余报道主要针对的是体外检材的检验[5, 6]。

本研究采用固相支撑液液萃取法[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]（solid supported liquid-liquid extraction, SLE）同时检测血液和尿液中氟胺酮及其代谢物去甲氟胺酮。SLE法是采用特殊工艺处理过的硅藻土为吸附剂, 利用其吸水性强、性质稳定的特点, 快速吸附样品基质中的水分, 在吸附剂表面形成液膜, 从而使目标物与水相分离, 实现对目标物的富集与净化。SLE 不仅省去了固相萃取法（solid phase extraction, SPE）的活化和淋洗步骤, 操作简单, 且避免了传统的液液萃取（liquid-liquid extraction, LLE）易产生乳化、基质效应高和样品用量大等缺点, 样品前处理时, 仅需上样和洗脱两步, 即可从水相中萃取目标化合物。因此, 本文建立的针对血液和尿液中氟胺酮及其代谢产物去甲氟胺酮的快速、高效的固相支撑液液萃取-液相色谱-串联质谱检测法, 在司法鉴定实践中具有重要意义。

1 材料与方法
1.1 仪器及试剂

仪器:Agilent 6470液相色谱– 三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）; AL204-IC型分析天平（瑞士Metlle Toledo公司）; Milli-Q Direct 8超纯水机（美国Millipore公司）。

试剂:氟胺酮（≥ 99.5%, 德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）, 去甲氟胺酮（1 mg/mL, 美国Cerilliant公司）, 乙酸乙酯、环己烷、氯仿、乙腈（色纯谱, 美国Fisher公司）, 甲酸（色谱纯, 德国Merck公司）。

空白血液由泸州市中心血站提供, 空白尿液由健康成年志愿者提供。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Hilic Plus RRHD（2.1 mm× 100 mm× 1.8 μ m）; 流动相:A相为10 mmol/L乙酸铵-0.2%甲酸-水溶液, B相为乙腈; 柱温:30 ℃; 流速:0.3 mL/min; 进样量:1 μ L; 后平衡时间3.0 min, 梯度洗脱条件见表1。

表1 HPLC梯度洗脱条件 Table 1 Gradient parameters for HPLC operation

1.2.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源（ESI）, 正离子扫描; 干燥气温度300 ℃; 干燥气流速10 mL/min; 雾化器压力40 psi; 屏蔽气:氮气, 气体温度380 ℃, 流量12 mL/min; 毛细管电压:4 000 V。检测方式:多反应监测（MRM）扫描。扫描参数见表2。

表2 氟胺酮及代谢物MRM离子、碎裂电压及碰撞能 Table 2 MRM conditions for F-ketamine and its metabolite
1.3 样品制备与提取

1.3.1 固相支撑液液萃取

取加标空白血液或尿液0.4 mL, 上样至固相支撑液液萃取SLE小柱, 施加0.1 Bar正压10 s使样品充分分散至填料上后, 静置10 min, 用 1 mL× 3环己烷洗脱, 控制其流速在1 mL/min左右, 每次在溶剂自然滴完后施加一个正压将柱中残余的液体挤出。洗脱液在30 ℃条件下用氮气吹至近干后, 用乙腈400 μ L涡旋振荡溶解, 过0.22 μ m膜, 用HPLC-MS/MS检测。

1.3.2 液液萃取

取加标空白血液或尿液0.4 mL, 加入乙酸乙酯1.0 mL, 涡旋振荡5 min, 10 000 r/min高速离心4 min, 将上清液取出至试管中, 按上述步骤重复三次, 合并上清液, 在30 ℃条件下用氮气吹至近干后, 用乙腈400 μ L涡旋振荡溶解, 过0.22 μ m膜, 用HPLC-MS/MS检测。

1.3.3 固相萃取

取加标空白血液或尿液0.4 mL, 过经甲醇和去离子水活化过的GDX 403 SPE小柱, 用3.0 mL去离子水淋洗小柱, 之后抽真空使小柱干燥, 用1.0 mL三氯甲烷洗脱3次, 洗脱液在30 ℃条件下用氮气吹至近干后, 用乙腈400 μ L涡旋振荡溶解, 过0.22 μ m膜, 用HPLC-MS/MS检测。

1.4 标准曲线溶液制备

分别取空白全血和尿液, 加入氟胺酮和去甲氟胺酮标准工作液, 配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的加标样品, 分别按照1.3.1中的方法提取后检测, 以待测物浓度为横坐标, 待测物峰面积为纵坐标, 建立血液、尿液标准工作曲线, 得出标准工作曲线方程及相关系数。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择

本文考察了Agilent Hilic Plus RRHD（2.1 mm× 100 mm× 1.8 μ m）、Agilent SB C18 Aq(2.1 mm× 50 mm× 1.8 μ m)、Agilent SB C18 RRHD（2.1 mm× 100 mm× 1.8 μ m）、Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm× 150 mm× 1.8 μ m）四种色谱柱。C18柱对于分子量相差不大的两个化合物（氟胺酮和去甲氟胺酮分子量相差14）分离度较差, 需要较长的色谱柱和较长的保留时间来达到分离效果。Hilic柱为反相色谱柱, 对强极性和强亲水性的化合物有较好的保留, 氟胺酮和去甲氟胺酮含有氟原子和胺基, 极性和亲水性较好, 故选择Hilic柱能达到较好的色谱峰形和分离度, 在1.2的仪器条件下Agilent Hilic Plus RRHD（2.1 mm× 100 mm× 1.8 μ m）对两种药物的分离效果、峰形较好, 由空白血液添加10 ng/mL氟胺酮和去甲氟胺酮色谱图（图1）可见, 氟胺酮和去甲氟胺酮的保留时间分别为:3.712和3.078 min。

图1 空白血液中氟胺酮和去甲氟胺酮混合标准色谱图Fig. 1 Chromatograms of F-ketmine and F-norketamine spiked into blank blood

2.1.2 流动相的选择

本文对比考察了乙腈和甲醇两种有机相以及纯水、0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵水溶液和0.2%甲酸+10 mmol/L乙酸铵水溶液五种水相体系。实验结果表明, 在0.2%甲酸+10 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈体系下, 两种药物均有较高的灵敏度、较好的分离度和较好的色谱峰形（见图1）, 故本实验选择0.2%甲酸+10 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相。

2.2 提取方法的选择

本文考察液液萃取法、固相萃取法、固相支撑液液萃取法三种提取方法, 三种提取方法的回收率见图2a。从实验结果可看出, SLE回收率最高, LLE、SPE对去甲氟胺酮的回收率较差。SLE相对于SPE 减少了柱活化和柱干燥的过程, 操作简单便捷。

图2 萃取条件优化（a:LLE、SLE、SPE方法对比; b:平衡时间优化; c:萃取试剂优化; d:萃取次数优化）Fig. 2 Optimization of extraction setups (a: comparison among LLE, SLE and SPE; b: balance time; c/d: extraction reagents/times)

2.3 SLE提取方法的优化

本文考察了SLE提取的平衡时间、洗脱溶剂和洗脱次数对回收率的影响。样品平衡时间选择5、10、15 min进行考察, 结果表明平衡时间10 min即可达到最高的回收率（见图2b）。洗脱溶剂选择环己烷、乙酸乙酯和三氯甲烷进行考察, 结果表明环己烷优于乙酸乙酯、三氯甲烷, 故选择环己烷作为洗脱溶剂（见图2c）。洗脱次数考察了1、3、5次, 每次用量1 mL溶剂对回收率的影响, 洗脱3次即可达到最高的回收率, 故选择3次洗脱次数（见图2d）。

2.4 基质效应、回收率和过程效率

采用提取后添加法建立数学模型评定基质效应在LC-MS/MS中使用的最多, 而且此法可同时考察提取回收率。按照Matuszewski等[15]的建议, 比较3个不同条件下的信号峰面积平均值, 其中Set1为纯的标准品溶液, Set2为不同来源的生物样品基质提取后添加, Set3为不同来源的样品基质提取前添加, 则基质效应ME=Set2/Set1, 提取回收率RE=Set3/Set2, 方法过程效率PE=Set3/Set1。血、尿中氟胺酮和去甲氟胺酮在1、50、200 ng/mL三种浓度下的基质效应、回收率和过程效率结果见表3。

表3 血、尿中氟胺酮和去甲氟胺酮基质效应、回收率和过程效率 Table 3 Matrix effect, recovery and processing efficiency of F-ketamine and F-norketamine in blood or urine
2.5 线性范围及最低检出限和最低定量限

结果表明全血和尿液中氟胺酮及去甲氟胺酮在0.5~200 ng/mL浓度范围内R2均大于0.99, 线性良好。线性方程、相关系数及最低检出限见表4。

表4 氟胺酮及去甲氟氨酮在血、尿中线性方程、线性范围、最低定量限及最低检出限 Table 4 Linear equation, linear range and LOQ and LOD of F-ketamine and F-norketamine in blood or urine
2.6 日内精密度和日间精密度

通过对1、50、200 ng/mL三个浓度去甲氟胺酮和氟胺酮在血液和尿液两种不同基质中的日内和日间精密度和准确度的考察发现, 本方法的精密度和准确度都很好（见表5）。

表5 氟胺酮和去甲氟胺酮在血、尿中的日内和日间精密度和准确度 Table 5 Precision and accuracy for F-ketamine and F-norketamine in blood or urine
3 结论

本文建立的固相支撑液液萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测全血和尿液中的氟胺酮和去甲氟胺酮, 样品前处理简单, 方法稳定性高, 提取回收率高, 基质效应小, 检测限低, 适用于血液和尿液中氟胺酮及其代谢物去甲氟胺酮的检验鉴定。

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