引用本文
徐越, 吴永富, 邹波, 夏赟, 蔡玉刚, 常靖. 自动固相萃取-气相色谱-串联质谱法分析血液中的2′-氯地西泮[J].刑事技术, 2021,46(3):269-272
XU Yue, WU Yongfu, ZOU Bo, XIA Yun, CAI Yugang, CHANG Jing. Determination of Blood-harbored 2′- Diclazepam with Auto-SPE and GC-MS/MS[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(3): 269-272  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.03.0060
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自动固相萃取-气相色谱-串联质谱法分析血液中的2′-氯地西泮
徐越1, 吴永富2, 邹波3, 夏赟4, 蔡玉刚2, 常靖3,*
1.惠州市公安司法鉴定中心,广东 惠州516001
2.泸州市公安局刑事科学技术研究所,四川 泸州 646000
3.公安部物证鉴定中心,北京 100038
4.深圳市公安局宝安分局刑警大队,广东 深圳 518004

第一作者简介：徐越,男,山西太原人,学士,副高级工程师,研究方向为刑事化验鉴定。E-mail：408100913@qq.com

基金资助: 公安部现场物证溯源技术国家工程实验室开放性课题（2018NELKFKT 13）
摘要

目的 建立自动固相萃取-气相色谱-串联质谱检测生物检材中新型安眠药物2′-氯地西泮的方法。方法 用全自动固相萃取法（SPE）对样品进行萃取,乙酸乙酯进行洗脱,然后用气相色谱-串联质谱仪进行测定。结果 2′-氯地西泮的质量浓度及其峰面积在0.02~20μg/mL之间呈线性关系,检出限（LOD）为10ng/mL,以空白血液为基体进行回收实验,用乙酸乙酯作为洗脱溶剂时回收率在81.8%~90.4%之间,测定值的相对标准偏差（ n=5）在 4.89%~5.47%之间。结论 该方法具有消耗检材量少、可操作性高、简便、准确和灵敏度高等特点。

关键词: 法医毒物学; 血液; 2′-氯地西泮;; 自动固相萃取; 气相色谱-串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2021)03-0269-04
Determination of Blood-harbored 2′- Diclazepam with Auto-SPE and GC-MS/MS
XU Yue1, WU Yongfu2, ZOU Bo3, XIA Yun4, CAI Yugang2, CHANG Jing3,*
1. Forensic Science Center of Huizhou Public Security Bureau, Huizhou 516001, Guangdong, China
2. Institute of Forensic Science of Luzhou Public Security Bureau, Luzhou 646000, Sichuan, China
3. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
4. Criminal Police Battalion of Shenzhen Baoan Public Security Sub-bureau, Shenzhen 518004, Guangdong, China
* 通信第一作者简介：常靖,女,陕西米脂人,硕士,研究员,研究方向为法医毒物检验、法医毒理学。E-mail: changjing73@126.com
Abstract

Objective To develop a GC-MS/MS method for determination of 2′-diclazepam in blood.Methods The sampling blood was extracted via HLB cartridge (a product from Waters Corporation, enabling operation of the auto-SPE (solid-phase extraction) for this determination) that was eluted with ethyl acetate, having the collected eluate subjected to GC-MS/MS analysis.Results For the 2′-diclazepam tested, a linear relationship was present between the concentration and peak area from the calibration curve in the range of 20~20μg/mL, demonstrating the limit of detection (LOD) being 10ng/mL. Moreover, the average recoveries were shown within the range of 81.8%~90.4%, and the relative standard deviations among 4.89%~5.47%.Conclusion The here-established method is of high sensitivity, selectivity and strong operability, suitable for determination of diclazepam in blood.

Key words: forensic toxicology; blood; 2-diclazepam; auto-SPE(solid-phase extraction); GC-MS/MS

随着社会经济技术的发展和对安眠镇静药物需求的增加, 一些用量少、作用好、毒副作用小的新型安眠镇静药物相继出现, 这些药物在服务人们的同时也为不法分子提供了犯罪机会。特别是近年来各地相继出现涉及2′ -氯地西泮的药物依赖、强奸、抢劫等案件, 引起刑事科学技术工作者的高度重视[1, 2]。2′ -氯地西泮（diclazepam, 或 2-chlorodiazepem）是设计型苯二氮䓬类药物, 分子量319.185, 分子式C16H12Cl2N2O, 其结构如图1。

图1 2′ -氯地西泮分子结构图Fig.1 Molecular structure of 2′ -diclazepam

目前国内外文献上报道的2′ -氯地西泮检验方法主要有气质联用法（(GC-MS）、傅里叶红外光谱法（FT-IR）、液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱法（LC-QE）和核磁共振（NMR）, 利用气质-三重四极杆联用仪法（GC-MS/MS）检验未见报道。本研究建立的全自动固相萃取技术-气相色谱-三重四极杆串联质谱仪不仅回收率高, 又具有气相色谱的高分离性能和MS/MS的多反应监测（MRM）定性定量准确的优点, 可有效去除基质干扰, 获得较高的灵敏度, 可为2′ -氯地西泮的相关检验鉴定提供参考。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂

安捷伦 7890B-7000C气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(Agilent Tecnologies, 美国); 吉尔森GX-274四通道全自动固相萃取仪(Gilson Aspec, 美国), 西格玛3H20RI型高速冷冻离心机（Sigma, 德国）。

标准品及标准溶液：2′ -氯地西泮标准甲醇溶液（1mg/mL, sigma-aldrich, 美国）, 用甲醇将其配制成其他浓度标准工作溶液。

试剂：甲醇、乙酸乙酯（Merck, 德国）, 磷酸氢钾、磷酸二氢钾（Sigma-aldrich, 美国）, 超纯水。

血液由疾控中心血站提供。

1.2 仪器条件

1.2.1 气相色谱条件

HP-5MS石英毛细管色谱柱（前15 m× 0.32 mm× 0.25 µ m, 后15 m× 0.32 mm× 0.25 µ m）, 反吹EPC; 柱温程序：起始温度150 ℃（保持2 min）, 升温速率20 ℃/min, 最终温度280 ℃（保持17 min）; 进样口温度 280 ℃, 传输线温度 250 ℃; 载气：高纯He; 柱流量：恒流 1 mL/min; 进样模式：分流进样, 分流比 15∶ 1, 进样：1 μ L。

1.2.2 质谱条件

传输线温度为280 ℃; 离子源：电子轰击源（EI）; 离子源温度为200 ℃; 电离能量为70 eV; 溶剂延迟 2.5 min; 淬灭气流速为2.25 mL/min; 碰撞气为高纯氮气(纯度为99.999%); 碰撞气流速为1.50 mL/min; 质谱扫描方式为多反应监测（MRM 模式）; 离子对见表1。

表1 2′ -氯地西泮的质谱采集参数 Table 1 Mass spectrometric parameters of 2′ - diclazepam

1.2.3 固相萃取条件

固相柱：以聚苯乙烯-二乙烯基苯-吡咯烷酮为填料的Waters Oasis HLB Cartridge固相萃取柱; 活化：用 3 mL甲醇、3 mL超纯水、2 mL pH6 磷酸盐缓冲液分别以 1 mL/min 的流速活化柱子; 上样：以 0.5 mL/min 的流速上样; 洗涤：按顺序分别用 2 mL pH6 磷酸盐缓冲液、3 mL 水以 1 mL/min 过柱洗涤; 干燥：离心干燥固相柱; 洗脱：3 mL乙酸乙酯以 0.5 mL/min 的流速洗脱, 氮吹浓缩至干, 甲醇定容至100 μ L备检。

1.3 样品前处理

取空白血液1 mL 3份, 添加2′ -氯地西泮至浓度分别为100、200和500 ng/mL, 分别加去离子水定容至6 mL, 在4 ℃下经10 000 r/min高速离心10 min后取上清液, 在1.2.3全自动固相萃取条件下对样品进行前处理, 氮吹浓缩至干, 甲醇定容至100 μ L供气相色谱-三重四极杆串联质谱检验。取空白血液1 mL 1份, 与检材平行操作, 作为空白对照检材[3]。

2 结果与讨论
2.1 萃取溶剂的选择

实验采用乙酸乙酯作为萃取溶剂, 同时比较了二氯甲烷以及乙醚作为萃取溶剂时的回收率（提取5次）, 结果表明三种有机溶剂相差不大（见表2）, 且考虑到乙酸乙酯对人体的毒害相对较小, 最终选择乙酸乙酯为萃取溶剂。

表2 萃取液回收率比较 Table 2 Comparison of extraction recoveries
2.2 萃取溶剂用量的选择

本研究考察了全自动固相萃取分别使用2、3、4 mL三种体积的萃取溶剂时对目标药物的回收率, 结果表明当萃取溶剂用量在3 mL时, 2′ -氯地西泮的回收率最高, 见表3, 故在最终选用3 mL乙酸乙酯洗脱。

表3 萃取溶剂用量比较 Table 3 Comparison of consumed extraction solvent
2.3 固相小柱的选择

本研究考察了Gilson Aspec-C18、Waters Oasis HLB Cartridge及Agilent Bond Elut Certify规格均为200 mg/3 mL的三种不同品牌的固相小柱。实验用空白血液添加相同量的2′ -氯地西泮, 分别经三种不同小柱的萃取后, 用3 mL的乙酸乙酯洗脱, 结果表明Water Oasis HLB Cartridge目标物回收率为81.80%, Gilson Aspec-C18目标物回收率为73.91%, Agilent Bond Elut Certify目标物回收率为67.39%, 结果表明Waters Oasis HLB Cartridge高于其他另外两种小柱, 因此本次研究试验最终选定Waters Oasis HLB Cartridge固相小柱为萃取柱。

2.4 质谱条件的优化

将5 μ g/mL 的2′ -氯地西泮标准溶液在1.2.1的色谱条件下, 采用全扫描方式获得目标物母离子, 利用碰撞气将母离子打碎后在二级质谱MS2收集子离子。根据不同碰撞能量下产生的子离子, 选择丰度相对较高、较稳定的子离子进行检测[4, 5]。再以1 μ g/mL 2′ -氯地西泮标准溶液进样分析, 其多重反应监测色谱图见图2。同时取空白血液一份1 mL, 按照1.2方法进行提取。结果表明在选定仪器条件下, 2′ -氯地西泮具有良好的色谱峰, 血液中内源性物质对2′ -氯地西泮的测定不产生干扰, 说明该方法具有良好的专属性。2′ -氯地西泮的色谱峰的保留时间为10.255 min。

图2 1μ g/mL 2′ -氯地西泮标准溶液的多重反应监测色谱图Fig.2 MRM chromatogram of 2′ -diclazepam (1μ g/mL) standard solution

2.5 回收实验

采用空白血样加标的方式进行回收率实验, 分别对50、200、1 000 ng/mL的浓度进行了考察, 每个浓度测定5次, 回收率和精密度结果见表4。

表4 回收率和精密度结果（n=5） Table 4 Recoveries and precisions obtained from test (n=5)
2.6 工作曲线和方法检出限

配制目标药物浓度分别为 20、50、100、200、500、1 000、2 000、10 000、20 000 ng/mL的标准溶液, 按1.2方法测定。以峰面积（y）对样品中药物的质量浓度（x, ng/mL）作图, 2′ -氯地西泮在0.020~20μ g/mL范围内线性关系良好, 线性回归方程为y=0.354× 102x+3.823× 103, 相关系数为R2=0.99906。以定量离子3倍信噪比（S/N）时响应的样品浓度为检出限（LOD）, 以10倍信噪比（S/N）时为定量检出限（LOQ）。血液中2′ -氯地西泮的检出限（LOD）为10 ng/mL, 定量检出限（LOQ）为20 ng/mL。

3 案例应用

2018年4月, 某市公安局辖区发生一宗麻醉强奸的案件：8日晚受害人舒某与一男子约会回家后状态异常, 10日受害人家人将其送往医院检查后发现其被性侵, 11日受害人在家人的陪同下到辖区派出所报案。据受害人描述, 她在喝下嫌疑人买的奶茶后有4~5 h的失忆。12日, 采用本文所述方法从受害人服药后第三天（约70 h）的血液中检出258 ng/mL的 2′ -氯地西泮及其代谢氯甲西泮、地洛西泮和劳拉西泮成分。

4 结 论

本文建立的血液样本中2′ -氯地西泮的自动固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱仪（GC-MS/MS）的检验方法重现性好, 检出限低, 易于操作, 适用于实际案件血液中2′ -氯地西泮的检验工作, 为法庭科学生物样品中该物质检测提供了借鉴。

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