仪器：Agilent 6470超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）; AL204-IC型分析天平（瑞士Metlle Toledo公司）; Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）; IKA涡旋振荡仪（德国IKA公司）。

试剂：2′ -氯地西泮（≥ 99%, sigma-aldrich, 美国）、地洛西泮（1mg/mL, sigma-aldrich, 美国）、氯甲西泮（1 mg/mL, sigma-aldrich, 美国）、劳拉西泮（1 mg/mL, sigma-aldrich, 美国）, 乙酸乙酯、甲醇、乙腈（色纯谱, fisher, 美国）, 乙酸铵、甲酸（色谱纯, merck, 德国）

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18 Aq（2.1 mm× 50 mm , 1.8 μ m）; 流动相：A相, 0.1%甲酸-水溶液; B相, 乙腈。柱温：35 ℃; 流速：0.2 mL/min; 进样量：1 μ L; 梯度洗脱条件：B相初始浓度为20%, 在8 min内由20%增加到95%并保持2 min, 整个实验过程用时10 min。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）, 正离子扫描; 干燥气温度：325 ℃; 干燥气流速：11 mL/min; 雾化器压力：35 psi; 屏蔽气：氮气, 气体温度400 ℃, 流量12 mL/min; 毛细管电压： 4 000 V。检测方式：多反应监测（MRM）扫描。2′ -氯地西泮及代谢物MRM离子及碰撞能见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 2′ -氯地西泮及代谢物保留时间/MRM离子及碰撞能(CE) Table 1 Retention time and MRM conditions of 2′ -diclazepam and its metabolites 目标物 保留时间/min 母离子 子离子 CE/V 2′ -氯地西泮 8.675 319.0 319.0> 154.0 24 319.0> 277.0* 28 地洛西泮 8.503 305.0 305.0> 140.0 35 305.0> 206.1* 40 氯甲西泮 8.483 335.0 335.0> 177.0 36 335.0> 289.0* 24 劳拉西泮 8.311 321.0 321.0> 275.0 18 321.0> 303.0* 12 注：* 为定量离子

表1 2′ -氯地西泮及代谢物保留时间/MRM离子及碰撞能(CE) Table 1 Retention time and MRM conditions of 2′ -diclazepam and its metabolites

取待测血液0.2 mL, 加入0.01 g氯化钠（组织0.5 g, 匀浆后加无水硫酸钠磨成沙状）, 加入乙酸乙酯2 mL, 超声萃取10 min, 涡旋振荡5 min, 10 000 r/min离心10 min, 重复提取两次, 合并有机相, 50 ℃氮吹浓缩挥干, 加入200 μ L甲醇定容, 涡旋30 s混匀, 过0.22 μ m滤膜, 待检。

分别取0.2 mL空白全血, 分别添加2′ -氯地西泮、地洛西泮、氯甲西泮、劳拉西泮储备液, 均配成0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 ng/mL空白添加样, 按照1.3中的方法提取后检测, 以待测物浓度为横坐标, 以待测物峰面积为纵坐标, 建立标准曲线, 并得出标准曲线方程及相关系数。

40只雄性SD大鼠（由西南医科大学动物实验中心提供）随机分为四组, 体重200 g± 10 g, 每组10只, 禁食12 h后, 第一组一次性灌胃给药2.625 mg/kg（参照地西泮临床上成年人每日最大剂量25 mg/d经体表面积换算后剂量）的2′ -氯地西泮, 分别在10、20、30、40、60、80、100、120 min和4、8、10、12 h以及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 d经大鼠尾静脉采血0.2 mL; 第二组作为血液空白对照组与第一组相同时间取血0.2 mL; 第三组一次性灌胃给药2.625 mg/kg的2′ -氯地西泮30 min后立即处死; 第四组作为内脏空白组与第三组同时处死, 立即解剖取脑、心脏、肝、肺、肾、睾丸, 按照1.3方法进行样品处理, 并按照1.2实验条件进行检验。

以上动物实验已通过西南医科大学实验动物伦理委员会审查。

数据用SPSS16.0进行统计分析。

在优化后的LC-MS/MS条件下, 得到样品中2′ -氯地西泮、地洛西泮、氯甲西泮、劳拉西泮的保留时间分别为：8.675、8.503、8.483、8.311 min, 空白血液添加的保留时间分别为：8.675、8.503、8.483、8.318 min。以血液和肝组织色谱图（见补充材料图S1）为例, 所有组分分离较好, 色谱峰峰形较好。

图S1

Fig.S1

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	图S1 2´ -氯地西泮及代谢物色谱图（a:血液中; b:肝组织中）Fig.S1 Chromatograms of 2´ -diclazepam and its metabolites in blood (a) and liver (b)

样品中2′ -氯地西泮、地洛西泮、氯甲西泮、劳拉西泮在0.05~50 ng/mL之间相关系数均在0.999 7以上, 线性良好, 最低检出限小于0.05 ng/mL。线性方程、相关系数及最低检出限见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 2′ -氯地西泮及代谢物线性方程、线性范围及最低检出限 Table 2 Linear equations, linear ranges and LODs of 2′ -diclazepam and its metabolites 名称 线性方程 线性范围/(ng/mL) 相关系数 最低检出限/(ng/mL) 2′ -氯地西泮 y=0.3233x+74.4626 0.05~50 0.999 7 0.01 地洛西泮 y=0.5459x+93.9889 0.05~50 0.999 9 0.04 氯甲西泮 y=1.4521x+137.4450 0.05~50 0.999 9 0.03 劳拉西泮 y=0.5726x+21.5712 0.05~50 0.999 9 0.05

表2 2′ -氯地西泮及代谢物线性方程、线性范围及最低检出限 Table 2 Linear equations, linear ranges and LODs of 2′ -diclazepam and its metabolites

实验表明, 2′ -氯地西泮、地洛西泮、氯甲西泮、劳拉西泮在0.5、5、20 ng/mL三个浓度下的日内和日间（48 h）精密度良好, 回收率在89.92%~101.27%之间（见表3）。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 血液中2′ -氯地西泮及代谢物的回收率及精密度(n=5) Table 3 Recoveries and precisions of 2′ -diclazepam and its metabolites in blood samples (n=5) 名称 浓度/(ng/mL) 回收率/% 精密度/% 日内 日间 （48 h） 2′ -氯地西泮 0.5 101.27± 1.563 8.05 9.24 5 92.14± 0.562 8.80 9.76 20 100.10± 0.464 8.17 8.62 地洛西泮 0.5 99.06± 2.464 9.02 7.22 5 92.27± 0.243 8.80 8.22 20 99.73± 2.261 8.28 8.64 氯甲西泮 0.5 96.78± 5.463 6.20 6.68 5 89.92± 0.476 6.61 7.76 20 98.03± 1.643 7.42 7.62 劳拉西泮 0.5 93.44± 3.741 5.93 7.42 5 90.15± 2.463 5.81 8.23 20 97.94± 1.413 7.32 7.60

表3 血液中2′ -氯地西泮及代谢物的回收率及精密度(n=5) Table 3 Recoveries and precisions of 2′ -diclazepam and its metabolites in blood samples (n=5)

实验表明, 2′ -氯地西泮灌胃进入大鼠体内后, 血液中的2′ -氯地西泮20 min左右均达到最大浓度, 随后逐渐衰减, 在40、80 min左右血液浓度出现相当于最高浓度73.5%和56.3%的峰值, 其一级代谢物地洛西泮和氯甲西泮在20 min左右均达到最大浓度, 在40、80 min出现最高浓度67.6%、31.2%和86.9%、55.9%的峰值, 二级代谢物劳拉西泮在30 min左右均达到最大浓度, 在60、100 min和4 h出现最高浓度80.5%、51.8%、28.8%的峰值, 结果见图1。

图1

Fig.1

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	图1 2′ -氯地西泮及代谢物在血液中的含量变化Fig.1 Metabolic changes of 2′ -diclazepam and its metabolites in blood

2′ -氯地西泮灌胃进入大鼠体内30 min后, 2′ -氯地西泮及代谢物在大鼠组织中的含量分布及平均值（$\bar{x}$）、相对标准偏差（RSD）结果见图2和表4。

图2

Fig.2

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	图2 2′ -氯地西泮及代谢物在大鼠组织中的含量分布Fig.2 Distribution of 2′ -diclazepam and its metabolites in rat tissues

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 2′ -氯地西泮及代谢物在大鼠组织中的含量分布(ng/g) Table 4 Distribution of 2′ -diclazepam and its metabolites in rat tissues 编号 组分 脑 心脏 肝 肺 肾 睾丸 编号 组分 脑 心脏 肝 肺 肾 睾丸 1 2′ -氯地西泮 18.11 18.92 105.31 11.30 16.22 14.73 7 2′ -氯地西泮 16.50 17.56 95.20 11.20 17.63 15.81 地洛西泮 5.18 2.83 24.80 0.84 2.67 1.04 地洛西泮 4.62 2.58 23.05 0.86 2.95 1.13 氯甲西泮 4.47 4.75 10.98 2.24 3.54 9.60 氯甲西泮 4.04 4.44 10.48 2.44 4.03 1.69 劳拉西泮 12.43 9.85 20.38 6.30 8.43 5.95 劳拉西泮 10.98 8.86 16.85 6.29 8.67 6.44 2 2′ -氯地西泮 16.33 17.15 96.66 11.09 17.59 15.97 8 2′ -氯地西泮 17.18 19.26 109.15 11.61 16.90 15.77 地洛西泮 4.55 2.47 22.79 0.83 2.88 1.09 地洛西泮 4.93 2.90 26.45 0.93 2.79 1.16 氯甲西泮 4.01 4.06 10.15 2.17 3.79 1.60 氯甲西泮 4.31 5.05 12.33 2.54 3.57 1.78 劳拉西泮 11.09 8.42 18.47 6.23 8.80 6.37 劳拉西泮 11.58 10.36 21.37 6.67 8.12 6.51 3 2′ -氯地西泮 16.92 19.13 105.58 11.44 16.69 16.27 9 2′ -氯地西泮 17.93 20.30 98.56 12.11 16.60 14.25 地洛西泮 4.72 2.78 24.87 0.85 2.74 1.15 地洛西泮 5.13 3.07 23.58 0.96 2.75 1.08 氯甲西泮 4.25 4.75 11.14 2.47 3.59 1.70 氯甲西泮 4.56 5.28 10.72 0.13 3.59 1.59 劳拉西泮 11.54 9.97 20.53 6.50 8.08 6.67 劳拉西泮 12.15 10.83 18.83 6.91 8.07 5.80 4 2′ -氯地西泮 17.83 20.05 97.40 11.69 16.70 14.35 10 2′ -氯地西泮 19.45 16.80 97.94 10.52 16.13 13.56 地洛西泮 5.09 3.02 23.01 0.92 2.67 1.04 地洛西泮 5.53 2.45 23.33 0.86 2.67 1.06 氯甲西泮 4.36 5.04 9.83 2.50 3.50 1.53 氯甲西泮 5.10 4.20 10.42 2.28 3.43 1.54 劳拉西泮 12.20 10.69 19.04 6.80 7.95 5.83 劳拉西泮 13.47 8.53 19.10 5.94 7.70 5.50 5 2′ -氯地西泮 18.97 16.85 99.53 10.29 16.38 13.56 $\bar{x}$ 2′ -氯地西泮 17.70 18.52 100.91 11.23 16.70 14.89 地洛西泮 5.38 2.46 23.16 0.81 2.60 1.03 地洛西泮 5.03 2.75 24.00 0.87 2.74 1.08 氯甲西泮 4.59 4.19 10.26 2.19 3.47 1.48 氯甲西泮 4.43 4.67 10.79 2.12 3.62 2.41 劳拉西泮 12.94 8.56 18.78 5.71 7.79 5.43 劳拉西泮 12.08 9.63 19.33 6.37 8.16 6.03 6 2′ -氯地西泮 17.77 19.21 103.82 11.04 16.18 14.61 RSD 2′ -氯地西泮 5.68% 7.11% 4.63% 4.81% 3.24% 6.72% 地洛西泮 5.21 2.92 24.95 0.88 2.69 1.09 地洛西泮 6.42% 8.74% 5.00% 5.56% 3.91% 4.34% 氯甲西泮 4.63 4.99 11.60 2.24 3.73 1.58 氯甲西泮 7.18% 9.14% 6.95% 6.21% 4.95% 6.32% 劳拉西泮 12.44 10.27 19.96 6.32 8.03 5.79 劳拉西泮 6.58% 9.83% 6.61% 5.82% 4.40% 7.22%

表4 2′ -氯地西泮及代谢物在大鼠组织中的含量分布(ng/g) Table 4 Distribution of 2′ -diclazepam and its metabolites in rat tissues

2′ -氯地西泮及三种具有生物活性的代谢物均系苯二氮卓类精神类药物, 进入体内后与人体中枢苯二氮卓受体结合而促进γ -氨基丁酸(GABA)的释放或突触传递功能, 当GABA受体激动时, Cl^-通道开放的数目增多, Cl^-进入细胞内数量增加, 产生超极化而引起抑制性突触后电位, 减少中枢内某些重要神经元的放电, 引起中枢神经系统的抑制作用。中毒症状一般为嗜睡, 共济失调, 大剂量时可导致昏迷, 血压下降, 呼吸循环抑制, 呼吸、心跳停止。

由于2′ -氯地西泮未被临床使用, 国内外文献未见对使用量等参数的报道, 本实验2′ -氯地西泮给药量参考地西泮成人临床剂量, 经体表面积换算公式换算, 且以灌胃的形式进行。预实验中以3 mg/kg的剂量灌胃大鼠后, 大鼠出现步态不稳、刺激性反射、烦躁性尖叫, 48 h内排尿明显减少。文献报道^[5]地西泮在给药后1 h达到血液最高浓度, 而2′ -氯地西泮2位有Cl^-取代, 较地西泮与机体结合更快, 作用更强, 实验数据表明, 2′ -氯地西泮进入大鼠体内后20 min内达到血液最高浓度, 代谢物地洛西泮和氯甲西泮在30 min以内达到最高浓度, 结合预实验不同时间处死大鼠进行的药物浓度检测, 确定30 min为大鼠处死时间。

实验结果表明, 2′ -氯地西泮在各组织中分布特点为：肝> 心脏> 脑> 肾> 睾丸> 肺; 地洛西泮在各组织中分布特点为：肝> 脑> 心脏> 肾> 睾丸> 肺; 氯甲西泮在各组织中分布特点为：肝> 心脏> 脑> 肾> 睾丸> 肺; 劳拉西泮在各组织中分布特点为：肝> 脑> 心脏> 肾> 肺> 睾丸。在给药20 min后, 2′ -氯地西泮很快分布于各个器官, 且含量较高, 说明2′ -氯地西泮有较高的亲脂性。实验表明, 2′ -氯地西泮及其代谢物在肝脏中的浓度均明显高于其他组织, 说明2′ -氯地西泮主要是通过肝脏代谢。

据文献报道^{[6, 7, 8]}, 2′ -氯地西泮在肝脏中其代谢途径为：1）N-1去甲基代谢为地洛西泮; 2）C-3羟基化代谢为氯甲西泮; 3）N-1去甲基和C-3羟基化代谢为劳拉西泮, 各代谢物与葡萄糖醛酸结合排出体外。2′ -氯地西泮及三种代谢产物均具有抑制中枢神经的生物活性, 且在脑组织中的2′ -氯地西泮和氯甲西泮含量仅次于肝脏和心脏, 地洛西泮和劳拉西泮的含量仅次于肝脏, 说明2′ -氯地西泮及代谢物均可以透过血脑屏障作用于大脑。

根据实验结果, 10只大鼠经灌胃给药2′ -氯地西泮后20 min内, 血液中2′ -氯地西泮及其代谢物氯甲西泮、地洛西泮均达到峰值, 代谢物劳拉西泮在30 min后均达到峰值。给药10 h后, 血液中的2′ -氯地西泮含量隆至峰值的0.0%~1.9%, 氯甲西泮含量降至0.0%~3.1%, 地洛西泮含量降至0.0%~14.9%, 12 h后均低于检出限, 在15 d监测中, 大鼠的血液中均能检出2′ -氯地西泮、地洛西泮、氯甲西泮和劳拉西泮。2′ -氯地西泮、氯甲西泮、地洛西泮的血液含量在灌胃给药40、80 min左右分别出现一个降低后的峰值, 劳拉西泮则在给药后60 min、4 h和7、13 d出现峰值。二次峰值出现的代谢规律是否因药物摄入方式所导致还是其他原因有待进一步研究。

实验结果表明, 血液中氯甲西泮的含量是地洛西泮含量的2倍左右, 2′ -氯地西泮C-3羟基化与N- 1去甲基化的代谢过程规律也有待下一步研究。2′ -氯地西泮常被用于麻醉抢劫和麻醉强奸, 出现致死情况较少, 受害者报案时间距案发时间较长, 能得到的体内检材常为血液和尿液, 本文对尿液中2′ -氯地西泮及代谢物也进行了监测, 在15 d均能检出。由于给药后大鼠出现少尿或无尿的情况, 未能建立数据模型, 故未展开研究。