引用本文
徐瑞光, 王林, 张启荣, 陈建军, 伊小凯, 卢晓军, 郭忠辉, 孙敬, 王利华, 张新生. 固定时间对中性缓冲福尔马林固定人体组织STR基因座检出率的影响[J]. 刑事技术, 2020, 45(1): 30-34。
XU Ruiguang, WANG Lin, ZHANG Qirong, CHEN Jianjun, YI Xiaokai, LU Xiaojun, GUO Zhonghui, SUN Jing, WANG Lihua, ZHANG Xinsheng. Effect of Fixation Time on Detecting STR loci from Human Tissues Fixed by Neutral Buffered Formalin[J]. Forensic Science and Technology, 2020, 45(1): 30-34.  
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固定时间对中性缓冲福尔马林固定人体组织STR基因座检出率的影响
徐瑞光1, 王林1, 张启荣1, 陈建军1, 伊小凯1, 卢晓军1, 郭忠辉1, 孙敬2, 王利华1,*, 张新生1,*
1. 包头市公安局刑侦支队,内蒙古 包头014030
2. 公安部物证鉴定中心,北京100038
* 通讯作者简介：张新生,男,内蒙古包头人,研究生,研究方向为公安管理。E-mail: 1173490209@qq.com;王利华,男,内蒙古包头人,学士,高级工程师,研究方向为刑事科学技术。E-mail: 24568674@qq.com

第一作者简介：徐瑞光,男,内蒙古包头市人,硕士,主检法医师,研究方向为法医物证学。E-mail: xuruiguang_1984@163.com

收稿日期:2018-11-06 网络出版日期:2020-02-15
基金项目:公安部技术研究计划项目（2016JSYJB03）
摘要

目的 研究固定时间对福尔马林缓冲溶液固定的人体组织DNA的STR基因座检出率的影响。方法 将心、肝、脾、肺、肾五种人体组织于室温在10%福尔马林中性缓冲溶液中固定,并在不同时间取样。磁珠法提取组织DNA,用AmpFSTR®identifiler® plus、AmpFSTR®MiniFiler®试剂盒分别进行扩增,扩增产物在ABI 3130 xL遗传分析仪上进行检测,用GeneMapperIDv3.2对STR基因座检出情况作分析。结果 随着固定时间延长,组织的STR基因座检出率下降明显。固定第30天时,使用Identifiler plus扩增系统可检出约80%的STR基因座,固定60、90d,STR基因座检出率分别下降到60%、20%左右。固定60d内的组织,使用Minifiler扩增系统可检出全部9个miniSTR基因座。心肺两种组织表现出较高的STR基因座检出率。结论 随着固定时间的延长,组织的STR基因座检出率下降明显,Minifiler可以作为常规扩增系统的有效补充,以提高长片段STR基因座的检出率。

关键词: 法医物证学; 缓冲福尔马林固定剂; STR分型
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)01-0030-05
Effect of Fixation Time on Detecting STR loci from Human Tissues Fixed by Neutral Buffered Formalin
XU Ruiguang1, WANG Lin1, ZHANG Qirong1, CHEN Jianjun1, YI Xiaokai1, LU Xiaojun1, GUO Zhonghui1, SUN Jing2, WANG Lihua1,*, ZHANG Xinsheng1,*
1. Baotou Public Security Bureau, Baotou 014030, Inner Mongolia, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Objective To investigate the detection rate of STR loci from human tissues fixed for different time with buffered formalin solution.Methods Five human tissues, heart, liver, spleen, lung and kidney, were fixed in 10% neutral formalin buffer under room temperature and sampled at different time. DNA was extracted from the above formalin-fixed tissues by immuno-magnetic beads, then subjected to PCR amplification with both AmpFSTR®identifiler® plus kit and AmpFSTR®minifiler® plus kit. Through ABI 3130xL genetic analyzer to detect the PCR products, the STR loci were analyzed by GeneMapperIDv3.2.Results With the elongation of fixation time, the detection rate was reduced of STR loci from tissues. A majority of STR loci could be detected by the Identifiler plus amplification system within 30 days after fixation although the detection rate gradually decreased from about 60% to 20% when the fixation time extended to 60 ~ 90 days. All of the 9 STR loci could be detected by the minifiler amplification system within 60 days of fixation. Both heart and lung, among all the 5 detected human tissues, had higher STR-loci detection rate.Conclusions The detection rate of STR loci decreased significantly with the prolongation of fixed time. Minifiler kit is capable of an effective supplement to the conventional amplification choice because of its improvement for the detection rate of larger fragmental STR loci.

Keyword: forensic genetics; neutral buffered-formalin fixative; STR typing

法医个体识别案件中难以获得新鲜或冷冻人体组织时, 以福尔马林固定的病理检材就时常会作为DNA的来源而成为法医物证检验的主要选用材料。福尔马林是医学和法医病理学实践中最常用的组织固定剂, 根据配制方法分为缓冲和非缓冲两类。目前法医病理检验中, 习惯用非缓冲福尔马林固定病理组织, 但是研究表明使用非缓冲福尔马林作为固定剂时, 当组织固定时间超过4 d, 便难以检出完整STR基因型[1, 2]。固定时间超过9 d , 只能检出50%的STR基因座。中性缓冲福尔马林是在10%的甲醛中加入磷酸盐, 使得溶液的pH值相对稳定, 适当离子强度的混合磷酸盐有对抗蛋白质聚沉的能力, 还能有效夺取蛋白质颗粒表面的水化层从而促进化学反应速率。按照病理技术操作规范要求, 常规应用中性缓冲福尔马林有助于提高组织固定质量[3]。研究表明, 因中性缓冲福尔马林可阻止pH值降低, 比非缓冲福尔马林更有利于DNA的保存[4]。目前, 罕有针对缓冲福尔马林固定组织的STR分型检出率受固定时间影响的研究, 为系统了解不同固定时间经中性缓冲福尔马林固定人体组织的STR基因座检出情况, 本文用心、肝、脾、肺、肾五种人体组织进行了比较研究。

1 材料与方法
1.1 材料及样品

10%中性缓冲福尔马林溶液参照文献[5]自配, 新鲜组织样品心、肝、脾、肺、肾取自本中心法医病理室尸检。每种脏器组织切成约2 cm3组织块, 用水冲去血污, 浸没于10%中性缓冲福尔马林中, 置于室温下固定保存。

1.2 取样

依次按固定时间第0（未固定的组织）、7、14、30、60、90 天取样。取样时, 沿各组织边缘剪取大小约0.5 cm3的组织小块, 每种组织取样本5份, 在流动水中冲洗24 h, 后剪碎置于1.5 mL离心管中备用。

1.3 DNA提取

在装有组织块的离心管中加入100 μ L 5% Chelex-100 (Bio-Rad)、50 μ L 1 mg/mL蛋白酶K (Roche)溶液、30 μ L 1 M DTT溶液, 混匀后放入56 ℃恒温震荡混匀器中孵育24 h。而后按ML超微量磁珠法提取试剂盒（长春博坤生物技术公司）技术手册操作。

1.4 STR分型结果分析

将提取的DNA样品作为模板, 使用AmpFSTR® identifiler® plus（Identifiler plus）扩增试剂盒进行PCR扩增, 反应总体积10 μ L, 扩增产物在ABI3130 xL分析仪上进行检测, 用geneMapperIDv3.2分析STR分型结果。将固定第30、60、90 天组织的DNA提取样品作为模板, 使用AmpFSTR® minifiler® PCR扩增试剂盒扩增, 反应总体积10 μ L, 分析方法同上。

2 结果
2.1 不同固定时间组织DNA的STR基因座检验结果

各组织DNA提取物的STR基因座检出数见表1。对相同固定时间点上所有组织DNA样品的STR基因座检出率进行分析, 结果见图1。固定14 d时, 各组织均能检测出较完整的STR基因座分型。固定30 d时, 小片段基因座“ 优势扩增” 现象明显, CSF1PO、D2S1338、D18S51等大片段基因座等位基因发生“ 丢失” （图2）, 基因座检出率约为80%。固定60 d时, STR基因座检出率进一步降低至60%左右。固定90 d时, 只能检出D8S1179、D3S1558、D19S433、Amelogenin等少数几个小片段基因座, 基因座检出率小于20%。

表1 各组织DNA提取样品以Identifiler plus扩增的STR基因座检出数（每种组织5个样本） Table 1 Quantity of STR loci from the extracted DNA (5 samples per tissue) amplified by Identifiler plus PCR kit

图1 不同固定时间组织的DNA提取产物经Identifiler plus扩增后STR基因座检出率的比较Fig.1 Detection rates of IdentifilerPlus-amplified STR loci of DNA from the tissues undergone for different fixation times

图2 缓冲福尔马林固定第0天（a）与第30天（b）肾组织Identifiler plus试剂盒扩增结果Fig.2 Performance of IdentifilerPlus kit to amplify the DNA from kidney tissues fixed in natural formalin buffer for 0 (a) and 30 (b) days

2.2 不同类型组织的STR基因座检测结果

随着固定时间的延长, 缓冲福尔马林固定的各组织均出现STR基因座检出率下降的情况。固定30 d之内, 心、肝、脾、肺、肾五种组织STR基因座检出率相当。固定60 d时, 心、肺两种组织的STR基因座检出率高于其余组织（图3）。

图3 各组织经缓冲福尔马林固定不同时间后以Identifiler plus扩增STR基因座的检出率比较Fig.3 Detection rates of IdentifilerPlus-amplified STR loci from each kind of tissue fixed with natural formalin buffer for different time

2.3 缓冲福尔马林固定不同时间的组织miniSTR基因座分析结果

将固定第30、60、90 天各组织的DNA提取样品, 使用MiniFiler扩增系统进行扩增并检验, 固定第30、60 天的组织均可检出9个miniSTR基因座的完整分型, 但在D16S539、Amel等个别基因座上有等位基因扩增不均衡现象。当固定时间达90 d后, 出现较长扩增片段D21S11、D7S820等位基因“ 丢失” 的现象（图4）。对比相同固定时间时, Identifiler plus与Minifiler扩增系统共有的9个STR基因座的检出率, Minifiler明显高于Identifiler plus（图5）。将Identifiler plus扩增系统中等位基因扩增片段小于296 bp的10个STR基因座（D8S1179、D21S11、D3S1358、TH01、D13S317、D19S433、vWA、TPOX、D5S818、AMEL）的检出率与Minifiler系统的STR基因座检出率进行比较, 结果显示随着固定时间的延长, Identifiler plus扩增系统中上述10个STR基因座的检出率显著下降, 固定90 d时, 检出率低于20%, 而此时Minifiler扩增系统的基因座检出率仍在80%以上（图6）。

图4 缓冲福尔马林固定组织DNA样品的Minifiler扩增结果（a：固定第60天心脏组织; b：固定第90天心脏组织; c：固定第90天肝脏组织）Fig.4 Minifiler-amplified STR loci of the DNA extracted from either the heart tissues fixed for 60 (a)/90 (b) days or liver tissues fixed for 90 days(c) in natural buffered formalin

图5 Minifiler扩增系统与Identifiler plus扩增系统二者共有的STR基因座检出率的比较Fig.5 Comparison of detection rates of the amplified STR loci commonly shared with both MiniFiler Kit and Identifiler plus Kit

图6 Minifiler扩增系统与Identifiler plus扩增系统中等位基因扩增片段小于296bp的STR基因座检出率比较Fig.6 Comparison of detection rates of STR loci shorter than 296bp, amplified with MiniFiler Kit and Identifiler plus Kit

3 讨论

福尔马林因其保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性方面均优于其他固定液, 故长期以来广泛应用于临床检验、医学或其他科学研究。福尔马林溶液中固定保存的组织会产生蛋白-蛋白、蛋白-核酸交联从而导致DNA片断化、降解或者核酸之间的交联[6, 7, 8]。再者, 固定剂中的甲醛被溶解氧氧化产生甲酸使溶液pH值降低也会导致DNA降解[9]。在法医或临床医学实践中, 习惯用非缓冲福尔马林溶液固定组织做病理切片, 但随着DNA检验技术在肿瘤筛查测序和法医个体识别中的广泛应用, 对固定组织进行DNA检验的必要性愈益显著。中性缓冲福尔马林由于在福尔马林中加入了磷酸盐, 既可提高组织固定质量, 又能阻止溶液pH值的降低, 故有利于DNA的保存, 因此对于法医检验来说, 应为一种相对“ 理想” 的固定剂。

本实验使用中性缓冲福尔马林固定五种人体组织, 在不同固定时间取样, 对其STR基因座检验情况进行了研究, 结果显示, 人体组织经中性缓冲福尔马林固定30 d时, 可检出80%左右的STR基因座, 固定60 d时, 仍可检出60%左右的STR基因座。相比对非缓冲福尔马林溶液固定组织的研究[1, 2], 经中性缓冲福尔马林溶液固定的组织, 获得有效STR分型的时限显著延长, 因此推荐使用中性缓冲福尔马林作为法医病理检验的固定剂。通过对缓冲福尔马林固定的心、肝、脾、肺、肾五种组织对比研究, 结果显示随着固定时间的延长, 心、肺两种组织表现出对福尔马林溶液较强的“ 抗性” , 具有较高的STR基因座检出率。

AmpFSTR® MiniFiler® PCR扩增试剂盒是AB公司研发的miniSTR扩增系统, 扩增后的PCR产物比常规STR 片段更小（约为100~300 bp）, 可适用于降解检材的STR检验。本实验研究结果显示, 对于固定60 d以内的组织, Minifiler扩增系统可检测出全部9个miniSTR基因座, 固定90 d时, 仍可检出7~8个miniSTR基因座。而在固定时间相同时, Identifiler plus扩增系统中相应STR基因座逐渐“ 丢失” , 检出率明显低于Minifiler扩增系统; 但Minifiler系统STR基因座数量少, 单独应用时个体识别能力低, 故应作为对常规扩增试剂盒检验的有效补充。为了解Minifiler检出率高是否仅是因为STR片段小所致, 实验中对Identifiler系统中等位基因扩增片段小于296 bp的10个基因座的检出率与Minifiler扩增系统的基因座检出率进行了比较, 结果后者仍高于前者, 原因可能是因为扩增系统基因座的增多, 加剧了对扩增体系中各组分的竞争所致, 因此需要对扩增系统进行优化改善以提高STR基因座的检出率。另外, Minifiler扩增系统在D16S539等个别较小片段基因座上有等位基因扩增不均衡现象, 需要在实践应用中谨慎分析。

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