超高效液相色谱-串联质谱法检验血斑中抗高血压药物
[李昕潼1 
, 张云峰2, * , 杨煜1 , 黄健2 , 常靖2 , 于忠山2 ]
, 张云峰, 杨煜引用本文
李昕潼, 张云峰, 杨煜, 黄健, 常靖, 于忠山. 超高效液相色谱-串联质谱法检验血斑中抗高血压药物[J].刑事技术, 2019,44(2):126-131
LI Xintong, ZHANG Yunfeng, YANG Yu, HUANG Jian, CHANG Jing, YU Zhongshan. Determining Hypertension-resistant Drugs in Bloodstains by UPLC- MS[J]. Forensic Science and Technology,2019,44(2): 126-131
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2019.02.008
LI Xintong, ZHANG Yunfeng, YANG Yu, HUANG Jian, CHANG Jing, YU Zhongshan. Determining Hypertension-resistant Drugs in Bloodstains by UPLC- MS[J]. Forensic Science and Technology,2019,44(2): 126-131
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超高效液相色谱-串联质谱法检验血斑中抗高血压药物
第一作者简介：李昕潼,女,天津人,硕士研究生,研究方向为法医毒物分析。Email:542860788@qq.com
摘要
目的 建立非渗透性客体（载玻片）和渗透性客体（滤纸）上血迹斑痕中3种钙离子通道阻滞剂类抗高血压药物的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。方法 采用空白外周静脉血加标后在非渗透性客体（载玻片）上制备成血斑,采用棉签提取法提取;空白外周静脉血和空白经血加标后分别在渗透性客体（滤纸）上制成血斑,采用剪取法收集。样品经甲醇沉淀蛋白法提取后,采用UPLC-MS/MS进行检测。在ACQUITY UPLC®HSS T3 （2.1mm×50mm,1.8μm）反相柱上分离,梯度洗脱,流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液,质谱采集为电喷雾正离子多反应检测模式（MRM）。结果 三种目标物在5~1000μg/L范围内具有良好的线性关系,决定系数（ R2）大于0.9915,检出限在0.1~0.2μg/L之间,添加浓度水平为10、100、500μg/L时,取25μL加标血液制成血斑,方法回收率为68.5%~90.7%,相对标准偏差在2.0%~15.0%之间。结论 本方法可用于多种客体上血斑中3种钙离子通道阻滞剂类抗高血压药物的法庭与临床毒物分析,为刑事案件中刻画血斑供体信息提供理论基础。
关键词:
血迹斑痕; 钙离子通道阻滞剂类抗高血压药物; 超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号:DF795.1
文献标志码:A
文章编号:1008-3650(2019)02-0126-06
Determining Hypertension-resistant Drugs in Bloodstains by UPLC- MS
Abstract
Objective For rapid screening of three-kind hypertension-resistant drugs of calcium channel blockers (nimodipine, nifedipine and felodipine) in bloodstains on non-permeable and/or permeable objects, a method was established by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) so that a theoretic foundation can be built up for depicting the donors of bloodstains from criminal cases.Methods The blank venous blood was spiked and dried onto one glass slide (representing the non-permeable object), with the so-prepared bloodstain being wiped by cotton swab. The filter paper, representing the permeable object, was similarly stained with the spiked blood, then having been clipped into pieces. The bloodstain samples (the wiped cotton-swabs or clipped filter pieces) were extracted by methanol, with the supernatant being detected by UPLC-MS/MS which was run with the mobile phase of acetonitrile - formic acid (0.1%) solution flowing through a phase-reversed column of ACQUITY UPLC®HSS T3 (2.1×50 mm, 1.8 μm), and taken of electrospray ionization multiple reaction detection mode (MRM) for mass spectrometry.Results The correlation coefficients ( R2) were more than 0.9915 among 5~1000 μg/L, with the detection limits between 0.1 and 0.2 μg/L, and the concentration levels being 10, 100 and 500 μg/L, respectively. The recovery was 68.5%~90.7% and the relative standard deviation was between 2.0% and 15.0%.Conclusion This method can be used onto a variety of objects carrying the bloodstains that contained the three kinds of hypertension-resistant drugs of calcium channel blockers (nimodipine, nifedipine and felodipine).
Key words:
bloodstains; hypertension-resistant drugs of calcium channel blockers; ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS)
刑事案件犯罪现场中, 血迹斑痕是最常见的体液斑痕。刑事技术人员对于血斑通常采用DNA检测[1], 但DNA数据库有限, 为了充分挖掘物证中潜在信息, 可以通过检测血斑中的某些药物成分推断血斑供体生活、生理特征, 为侦查破案提供线索。目前, 国内外尚未对通过检测血斑中药、毒物成分来推断血斑供体特征的方法展开系统研究[2, 3, 4, 5, 6]。
本研究以高血压为供体特征展开研究, 选取3种广泛使用的1, 4-二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂类抗高血压药物进行研究, 建立了选择性强、重现性好的检测血斑中硝苯地平、尼莫地平、非洛地平3种药物的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法, 从而为实践提供参考, 为侦查提供方向。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Waters Acquity UPLCTMXevo TQ系统（美国Waters公司）; Milli-Q（美国Millipore公司); 美国Cole-Parmer 8892 超声振荡器; EYELA CUTE MIXER CM100高速振荡器（日本EYELA公司）; 德国Sartorius CP225D电子天平; LX-200迷你离心机（海门市其林贝尔仪器公司）。
乙腈、甲醇（色谱纯, 美国Fisher Scientific公司）, 其他试剂均为分析纯。空白外周静脉血来自北京市复兴医院, 空白经血来自健康的志愿者。尼莫地平（纯度≥ 99%, 加拿大TRC公司）、硝苯地平、非洛地平（纯度≥ 99%, 中国食品药品检定研究院）。
标准溶液的制备：分别准确称取10.00 mg的硝苯地平、尼莫地平、非洛地平标准品, 用甲醇溶解并定容至10 mL, 配成1.0 mg/mL的标准储备液。分别吸取适量单标储备液, 用甲醇逐级稀释制备成100、10、1 μ g/mL以及500.0 、100.0、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng/mL的混合标准溶液, 密封, 储存于棕色瓶中, 于-20 ℃保存。
1.2 样品的制备与前处理
1.2.1 渗透性客体上血迹斑痕的制备与提取
取0.9 mL空白静脉血、经血样品分别置于1.5 mL塑料离心管中, 添加100 μ L混合标准品, 涡旋振荡10 s, 充分混匀, 取25 μ L加标血液滴在干燥滤纸上, 自然环境下晾干。3 h后, 用干净的剪刀剪取血斑, 剪碎, 放入1.5 mL离心管中, 加入250 μ L甲醇, 超声5 min, 充分混匀, 离心5 min（7000 r/min）。取全部上清液经0.22 μ m有机膜过滤, 滤液供UPLC-MS/MS分析。
1.2.2 非渗透性客体上血迹斑痕的制备与提取
取0.9 mL空白静脉血样品置于1.5 mL塑料离心管中, 添加100 μ L混合标准品, 涡旋振荡10 s, 充分混匀, 取25 μ L加标血液滴在干净载玻片上, 自然环境下晾干。3 h后, 用湿润的棉签（100 μ L去离子水润湿）擦取血斑, 剪掉棉签头, 放入1.5 mL离心管中, 加入250 μ L甲醇, 超声5 min, 充分混匀, 离心5 min（7000 r/min）。取全部上清液经0.22 μ m有机膜过滤, 滤液供UPLC-MS/MS分析。
1.3 色谱条件
选用Waters ACQUITY® HSS T3（2.1 mm× 50 mm, 1.8 μ m）色谱柱; 柱温35 ℃; 进样量2 μ L, A相为0.1 %甲酸水, B相为乙腈。洗脱模式见表1。
 | 表1 超高效液相色谱梯度洗脱模式 Table 1 Eluting gradient used for ultra-performance liquid chromatography |
1.4 质谱条件
采用电喷雾离子源正离子扫描模式（ESI+）, 多反应监测扫描模式（MRM）; 源温度（TEM）：150 ℃; 脱溶剂气温度：500 ℃; 脱溶剂气流速：1000 L/h; 碰撞气体流量：0.15 mL/min。
2 结果与讨论
2.1 质谱与色谱条件的选择
2.1.1 质谱条件的选择
本研究中3种目标物均为1, 4-二氢吡啶类化合物, 采用正离子模式直接进样分析标准溶液, 确定各目标化合物的母离子后, 子离子扫描方式进行二级质谱分析, 对子离子进行优化选择, 确定定量离子对和定性离子对。通过优化电喷雾电压、雾化器电压、碰撞电压、去簇电压等质谱参数, 使每种化合物的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。3种目标物的详细质谱条件见表2。
| 表2 3种目标物的ESI + - MRM条件 Table 2 ESI + - MRM conditions for determining three hypertension-resistant drugs |
2.1.2 色谱条件的选择
比较了Water ACQUITY UPLC® HSS T3（50 mm× 2.1 mm, 1.8 μ m）、Water ACQUITY UPLC® HSS C18（50 mm× 2.1 mm, 1.8 μ m）两种色谱柱, 第一种色谱柱对目标物分离效果最好, 且呈现的峰形光滑无拖尾, 因此选用Water ACQUITY UPLC® HSS T3（50 mm× 2.1 mm, 1.8 μ m）色谱柱。比较了0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈两种流动相分析结果的影响。选用乙腈时峰形更好, 分离效果更优。因此, 选择了乙腈和0.1%甲酸为流动相。在此基础上优化了流动相梯度洗脱条件, 起始时水相比例选用90%, 有利于血斑中极性基质化合物先被洗脱出来, 减少对样品化合物电离时的基质干扰; 在流动相等度条件下, 有利于目标化合物峰形对称, 信号强度增大。
2.2 样品前处理方法的选择
2.2.1 提取方法的优化
考察了非渗透性客体（载玻片）上采用刮取法与棉签擦取法的检测结果。采用刮取法提取效果最好, 但是表面粗糙的非渗透性客体（如桌面等物体）上血迹会附着在客体的表面缝隙中, 无法实现刮取法提取, 因此实验采用棉签擦取法。其中棉签擦取法考察了干燥棉签、用去离子水润湿的棉签、用甲醇润湿的棉签、用乙腈润湿的棉签提取血迹斑痕。由于遗留的血斑在光滑的非渗透性客体（如玻璃、塑料、瓷砖等）上会形成破碎的血痂状, 使用干燥棉签、甲醇润湿的棉签、乙腈润湿的棉签易造成血渣飞溅, 难以收集。因血斑中水分含量较少, 更容易被用去离子水湿润的棉签吸附, 因此选用去离子水润湿的棉签。在此基础上考察了用100、500和1000 μ L去离子水润湿的棉签的提取效率, 使用100 μ L去离子润湿的棉签提取效率最高。
2.2.2 前处理方法的选择
血迹斑痕提取载体为棉签和滤纸, 使用固相萃取不易提取且损失较大, 且血斑与血液相比更为干净, 选用简单的沉淀蛋白法提取, 并不会对色谱柱的寿命产生影响。此外, 3种目标物极易溶于丙酮, 因此实验考察了有机试剂沉淀蛋白法直接提取和液液萃取法, 实验考察了100%甲醇、100%乙腈作为沉淀剂的沉淀蛋白法和丙酮液液萃取的检测结果, 100%甲醇作为沉淀剂的沉淀蛋白法回收率最大且稳定性最好。
2.2.3 基质效应的影响
基质效应指基质中的共提取干扰物影响目标物的离子化, 从而使目标物在仪器上的响应发生增强或抑制。因此, 需要对目标物在不同基质中的基质效应进行评价。实验中分别测定标准品溶液的色谱峰面积（S1）和空白样品基质提取液添加标准品溶液后的色谱峰面积（S2）, 以比值S2/S1（%）评价基质效应。实验考察了外周静脉血斑在非渗透性客体（载玻片）、渗透性客体（滤纸）, 经血斑在渗透性客体（滤纸）上的基质效应。目标物在10、100和500 μ g/L浓度时基质效应平均值在85%~115%, 无明显基质效应, 结果见表3。
| 表3 3种钙离子通道阻滞剂类抗高血压药物的基质效应和平均回收率 Table 3 Matrix effect, recoveries of analytes in bloodstains containing three-kind hypertension-resistant drugs of calcium channel blockers |
与外周静脉血斑相比, 经血斑因为成分更为复杂, 基质效应更大, 会对检测信号产生抑制作用, 因此经血斑中药物的检测限比外周静脉血斑中药物检测限高。
2.3 方法评价
2.3.1 方法的专属性
取空白外周静脉血25 μ L分别滴在非渗透性客体（载玻片）和渗透性客体（滤纸）, 空白经血滴在渗透性客体（滤纸）上, 按照1.2项方法处理, 均未检出任何成分。取空白血0.9 mL, 添加0.1 mL 500 μ g/L混标溶液, 按照1.2项方法处理, 得到色谱图1~3。结果表明, 外周静脉血斑、经血斑中的内源性物质对于这三种抗高血压药不产生干扰。
 | 图1 非渗透性客体（载玻片）上检测加标静脉血斑色谱图Fig.1 Chromatogram of labeled venous blood spots on non-permeable objects (slides) |
 | 图2 渗透性客体（滤纸）上检测加标静脉血斑色谱图Fig.2 Chromatogram of labeled venous blood spots on permeable objects (filter paper) |
 | 图3 渗透性客体（滤纸）上检测加标经血斑色谱图Fig.3 Chromatogram of labeled menstrual blood spots on permeable objects (filter paper) |
2.3.2 线性方程及检出限
取空白血添加3种抗高血压药物标准品, 制成5、10、50、100、500和1000 μ g/L的样品, 按照1.2项制成血斑后提取, 进行UPLC-MS/MS分析, 以定量离子的峰面积对质量浓度绘制标准曲线, 在5~1000 μ g/L浓度范围内, 三种抗高血压药物均呈良好的线性关系, 结果见表4~6。
| 表4 渗透性客体（滤纸）上3种抗高血压药物工作曲线（静脉血斑） Table 4 Linear regression equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) of analytes (filter paper- carried venous bloodstain) |
| 表5 渗透性客体（滤纸）上3种抗高血压药物工作曲线（经血斑） Table 5 Linear regression equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) of analytes (filter paper-carried menstrual bloodstain) |
| 表6 非渗透性客体（载玻片）上3种抗高血压药物工作曲线（静脉血斑） Table 6 Linear regression equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) of analytes (slide-carried venous bloodstain) |
取空白血添加3种抗高血压药物标准品, 制成0.1、0.2、0.5和1 μ g/L的样品, 按照1.2项制成血斑后提取, 进行UPLC-MS/MS分析, 以信噪比（S/N）=3计算3种抗高血压药物检测线（LOD）, 结果见表4~6。检出限（S/N=3）小于正常服药者的血药浓度, 可以满足实际办案的需要。
2.3.3 回收率和精密度
取空白血0.9 mL, 添加不同浓度的抗高血压药物标准工作溶液, 制成低、中、高浓度（10、100、500 μ g/L）的加标血液, 按1.2项制成血斑并提取, 用检测的色谱峰面积与混合标准品溶液的色谱峰面积的比值计算回收率, 见表3。日内精密度和日间精密度均采用添加水平为10、100、500 μ g/L的空白血液, 按1.2项方法制成血斑并提取、检测。日内精密度由重复试验6次测定得到, 日间精密度由连续3天重复进样检验得到。日内、日间精密度均不大于15%, 表明方法精密度良好, 结果见表7。
| 表7 3种钙离子通道阻滞剂类抗高血压药物的日内、日间精密度 Table 7 Intra- and inter-day precisions of analytes in bloodstains |
3 应用
取空白静脉血0.9 mL, 添加不同浓度的抗高血压药物标准工作溶液, 制成低、高（10、500 ng/mL）两种浓度的储备液, 模拟经常服药者血药浓度和偶尔服药者血药浓度, 取25 μ L加标血液滴在渗透性客体（卫生纸、棉布）和非渗透性客体（光滑瓷砖、粗糙瓷砖、塑料制品）上, 按1.2项制成血迹斑痕后提取、检测。此外, 在半渗透性客体（木头）上按1.2项制成血斑, 采用刮取法、甲醇沉淀蛋白法提取, 检测。每一个浓度平行3个样品进样, 均能够检出。
取空白经血0.9 mL, 添加不同浓度的抗高血压药物标准工作溶液, 制成低、高（10、500 ng/mL）两种浓度的储备液, 取25 μ L加标经血滴在渗透性客体（卫生纸、卫生巾、棉布）上, 按1.2项制成经血迹斑痕后提取、检测。每一个浓度平行3个样品进样, 均能够检出。
4 总结
本文建立了用甲醇沉淀蛋白法提取渗透性客体（滤纸）上的外周静脉血斑、经血斑以及非渗透性客体（载玻片）上的血迹斑痕, 以UPLC-MS/MS检测血迹斑痕中三种钙离子通道阻滞剂类抗高血压类药物的方法。该方法适用于在犯罪现场中提取血迹斑痕和检测其中三种钙离子通道阻滞剂类抗高血压类药物, 操作简单, 重现性好。可以实现通过检测血迹斑痕中抗高血压药物刻画血迹斑痕供体的高血压特征, 为刑事侦查提供线索。随着当前犯罪分子反侦察意识的不断增强, 犯罪手段的不断翻新, 对法庭科学中各个学科之间的交叉合作提出了新的要求和挑战。由于DNA检测和法医毒理学检测都属于有损检验, DNA检测使用的试剂对质谱检测信号会起到削减作用, 而甲醇、乙腈等沉淀剂的使用破坏物证中的DNA。因此, 要将法医毒理学和DNA检测技术结合起来充分挖掘物证信息, 还需要进行进一步研究。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。
参考文献
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