引用本文
孙帅, 张庆霞, 胡玉龙, 薛卢艳, 刘金杰, 唐晖, 刘力. King Fisher法提取指纹DNA的法医学应用研究[J].刑事技术, 2017,42(4):289-293
SUN Shuai, ZHANG Qingxia, HU Yulong, XUE Luyan, LIU Jinjie, TANG Hui, LIU Li. Forensic Applicability of King Fisher Method to Extract Fingerprint DNA[J]. Forensic Science and Technology,2017,42(4): 289-293  
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King Fisher法提取指纹DNA的法医学应用研究
孙帅1, 张庆霞2, 胡玉龙3, 薛卢艳2, 刘金杰2, 唐晖2,*, 刘力2
1.山西医科大学晋祠学院,太原 030001
2.北京市公安司法鉴定中心,北京 100192
3.鄂尔多斯市公安局禁毒支队,内蒙古 鄂尔多斯 017000
* 通讯作者：唐晖（1969—）,女,上海人,博士,主任法医师,研究方向为法医物证学。E-mail：huihuitangno1@163.com

第一作者简介：孙帅（1989—）,男,山西忻州市人,硕士研究生,研究方向为DNA的法医学研究与应用。E-mail:ss0030@163.com

摘要

目的 研究King Fisher法提取指纹DNA的法医学可应用性。方法 研究不同拭子随不同放置时间与提取方法其上DNA的提取效果及其在案件中的实际应用。结果 若STR基因座检出百分比≥90%,则King Fisher植绒拭子、擦拭一号、普通棉签对应可检出DNA的指纹数分别为8、10和5例;当以King Fisher植绒拭子擦拭指纹并放置1、3、5、7d后,所提取DNA能检出90%STR基因座的指纹数分别为10、7、6和4例;5种DNA提取方法Automate、Chelex-100、Qiagen、Maxwell与King Fisher可检出DNA指纹数分别为6、4、9、1和7例。结论 STR基因座检出百分比≥60%时,采用植绒拭子擦拭、King Fisher法提取DNA的检出样本数最多;样本检出个数随时间递减,为防止指纹DNA降解,建议3d内提取;5种DNA提取方法中,King Fisher法STR基因座检出百分比≥60%时的提取能力最高,而90%以上检出率的提取能力却不及Qiagen;对案件检材DNA,模板量≥0.01ng时,模板量与rfu值同比增高,相应STR基因座检出百分比≥60%。

关键词: 指纹DNA提取; 接触性DNA; STR基因座; 植绒拭子
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2017)04-0289-05 doi: 10.16467/j.1008-3650.2017.04.006
Forensic Applicability of King Fisher Method to Extract Fingerprint DNA
SUN Shuai1, ZHANG Qingxia2, HU Yulong3, XUE Luyan2, LIU Jinjie2, TANG Hui2,*, LIU Li2
1. Jinci College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
2. Beijing Judicial Identification Center of Public Security, Beijing 100192, China
3. Counter-narcotics Detachment of Ordos Public Security Bureau, Ordos 017000, Inner Mongolia, China
Abstract

Objective To analyze the forensic applicability of King Fisher method to extract fingerprint DNA.Methods The extracting efficiency was investigated in the aspects of different swabs, deposited time of transferred fingerprint DNA, various extracting methods and diverse samples from actual cases.Results The amount of fingerprint sample, whose DNA STR loci exposure was set to no lower than 90%, was respective of 8 for flocked swab, 10 for Swab No.1 and 5 for cotton swab. With fingerprint DNA transferred by King Fisher’s flocked swabs that were kept at room temperature for 1, 3, 5 and 7 days, the relevant quantity of fingerprint sample was respective of 10, 7, 6 and 4 to have their STR loci exposed no less than 90%. For the five methods of Automate, Chelex-100, Qiagen, Maxwell and King Fisher to extract fingerprint DNA, their respective performance was of 6, 4, 9, 1 and 7 samples to make their STR loci exposed ≥90%.Conclusion When the STR loci exposure is ≥ 60%, the maximal quantity of tested sample is reached by flocked swab (King Fisher’s) to transfer fingerprint DNA although such a number is declining along with the time elapsing for the sake of DNA degradation. Therefore, it is advisable to extract DNA within 3 days. However, if the STR loci exposure is set ≥ 90%, King Fisher’s is inferior to Qiagen’s for their DNA extraction. With the mass of DNA template ≥ 0.01ng to be extracted with King Fisher method, the quantity of template increases with the rfu value raising under the STR loci exposure ≥ 60% for the case samples.

Key words: fingerprint DNA extraction; contact DNA; STR locus; flocked swab

接触性DNA现已成为法医遗传检验的重要生物证据 [1, 2], 其是供者与客体或他人发生物理接触之后自身物质遗留于后者的结果（即Locard交换定律：“ 每次接触都会遗留有痕迹” ）[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]。指纹是接触性检材, 其DNA提取效率不高。而King Fisher磁珠提取纯化系统可用于纯化DNA、RNA、蛋白质和细菌, 不仅速度和准确性很高, 其专门设计的磁棒磁套还能避免与样品（溶液或磁珠）直接接触, 故无交叉污染和试剂夹带, 提取效果好。本文重点探讨采用不同拭子, King Fisher法提取DNA的STR基因座数目随时间延长的检出情况; 比较该法与其他4种提取方法STR基因座的检出数量; 探讨该法检出STR基因座数目与DNA模板量以及rfu值之间的关系。

1 材料与方法

King Fisher磁珠提取纯化系统（Thermo scientific, 芬兰）, 载玻片(经84消毒液浸泡20 min, 再用无水酒精浸泡10 min, 用清水冲洗5~7遍, 在无污染环境中晾干), Human Identifier扩增试剂, 9700扩增仪, 3130xL Analyzer电泳仪, Gene Marker HID® V2.6.13软件, 7500实时PCR定量仪, 以及配套试剂Quantifiler® TRio DNA Quantification Kit。室温下, 随机选取相应数量的受试者(受试双手经清水清洗、晾干, 勿接触其他任何客体表面), 并进行单手指纹按压。按压条件：在载玻片上按压10 s, 压力2 N。

1.1 拭子的选择

随机选择10名受试者（男、女各5名）进行指纹按压。在忽略同一个体单手指纹STR基因座数目检出差异的情况下, （非重复）采集每名个体左右手相应的3对同名手指（即选择同一个体对应的如食指、中指、无名指等）指纹。将指纹分成3组, 分别采用擦拭1号（博坤）、普通棉签、植绒棉签进行擦拭, 每组20个不同样本。采用King Fisher法提取DNA。

1.2 放置时间对指纹DNA提取的影响

在忽略同一个体双手指纹STR基因座数目检出差异的情况下, 随机选择12名受试者（男、女各6名）, （非重复）采集受试个体的相应左右手同名手指指纹各4对, 然后均采用植绒棉签拭子擦拭检材, 在15~20 ℃（或室温）下, 将这些转移了指纹DNA的植绒棉签拭子置于密闭的离心套管中, 分别存放1、3、5、7 d。每一时间段的样本指纹数均为24枚, 4个阶段共96枚指纹以King Fisher法提取其各自DNA。

1.3 五种DNA提取方法的比较

在忽略同一个体双手指纹STR基因座数目检出差异的情况下, 随机分别（非重复）采集6名男性（依次编号为M1、M2、M3、M4、M5、M6）与6名女性（依次编号为F1、F2、F3、F4、F5、F6）受试个体相应的左右手同名手指指纹各5对（同一个体的每一对同名手指指纹使用同一种方法提取）, 共计120枚。采取植绒棉签擦拭, 擦拭指纹的植绒棉签置于离心套管中, 以下列各提取方法分别处理24枚指纹, 具体操作为:1）Automate：每个样品选用BTA裂解液150 μ L, 蛋白酶K 15 μ L; 2）Chelex-100：每个样品加入150 μ L; 3）Qiagen：每个样品选用裂解液300 μ L, 蛋白酶K 20 μ L; 4）Maxwell：每个样品选用裂解液300 μ L; 5）King Fisher：每个样品选用裂解液250 μ L, 蛋白酶K 20 μ L。

1.4 提取不同载体上的案件检材指纹DNA

检材A（门把手、柜门抽屉）、B（衣物、纺织、鞋）、C（电源线、USB接口、电缆线）、D（工具刀、菜刀、钳子的擦拭物）等共四类检材的普通棉签擦拭物, 以King Fisher法提取DNA, DNA定量。

2 结果
2.1 King Fisher法提取不同拭子擦拭指纹DNA的情况（表1）
表1 King Fisher法用不同拭子提取的DNA检出基因座数目比较 Table 1 Comparison of the number of STR loci tested from different swabs where the carried DNA was extracted with King Fisher method
2.2 指纹放置时间对King Fisher法提取DNA的影响（表2）
表2 植绒棉签擦拭指纹随时间以King Fisher法提取的DNA STR基因座检出数目 Table 2 The number of tested STR loci changing along with the time when flocked swabs having wiped fingerprints were kept for the DNA to be extracted by King Fisher method
2.3 五种指纹DNA提取方法的比较（表3）
表3 五种指纹DNA提取方法的结果(A: automate; C: Chelex-100; Q: Qiagen; M: Maxwell; K: King Fisher) Table 3 The performance of 5 methods to extract fingerprint DNA (A: automate; C: Chelex-100; Q: Qiagen; M: Maxwell; K: King Fisher)
2.4 不同客体上的案件检材指纹STR基因座数目检出情况以及DNA定量结果（表4）
表4 King Fisher法提取不同客体上的案件检材STR基因座数目以及DNA定量结果 Table 4 The number of tested STR loci and quantified DNA extracted with King Fisher method from different carrying objects in actual cases
3 讨论

King Fisher法提取DNA是通过将携带样品的磁珠置于微孔板或管中, 以表面套有专用磁套的磁棒进行处理操作。具体步骤如下：

1）收集磁珠。将磁棒完全插入磁套, 并与磁套一起在样品（磁珠）液中上下移动, 从而磁珠被磁棒透过磁套吸附于磁套下部。

2）清洗磁珠。这是提取纯化最为关键的一步。目的在于将那些与磁珠非特异性结合的杂质洗去, 从而提高产物的纯度。清洗时, 磁套下降进入清洗缓冲液, 而磁棒停留在上方, 通过磁套的上下运动, 使得磁珠在溶液中充分混合。为了最大程度的实现清洗效果, 可以选择不同的混合速度用于优化实验结果, 如Bind It软件支持5种不同的混合速度, 而且不同的速度之间可以进行组合。此外, 经优化设计的磁套, 可确保在磁头转移时没有任何挂液现象。

3）磁珠洗脱与释放。经过清洗缓冲液处理的磁珠, 通过磁棒转移至盛有洗脱液的样品管中, 进行洗脱。其过程与清洗磁珠类似, 在洗脱的过程中可以选择进行动能洗脱或孵育。动能洗脱是通过磁套的上下运动, 将磁珠与洗脱液充分混合接触, 从而加速样品从磁珠上释放出来。通常, 洗脱时, 采用最小的洗脱液体积, 如初始样品200 μ L, 洗脱液20 μ L, 如此就可将样品浓缩10倍, 从而提高产物的浓度。

3.1 不同拭子擦拭指纹用King Fisher法提取DNA的结果分析

生物样本DNA的转移会受到其载体影响[8, 9, 10, 11, 12, 13]。从不同载体上获得生物样本DNA的效率有差别[10, 14]。本研究不同擦拭方法对于指纹DNA的检出率, 当STR基因座检出百分比≥ 90 %时, 擦拭一号检出的样本数目最多, 而植绒棉签拭子擦拭所检出的样本为擦拭一号的80 %, 差别不大。

3.2 指纹DNA（采用植绒棉签擦拭转移的检材）随不同时间提取的结果分析

DNA证据, 如何转移并保持其不降解以及核实有关检材出现在犯罪现场的原因至关重要 [15]。关于样品储存时间, 已有关于载体上DNA检材降解的研究[8, 9, 13, 16, 17]。本文通过分析不同存放时间的指纹DNA经King Fisher法提取的效率变化, 发现STR基因座检出百分比≥ 90%时, 随时间延长, 相关的样本检出数目递减（表2）。故在处理新鲜指纹（即刚按压出的指纹）DNA时, 为防止降解并确保STR基因座检出百分比≥ 90 %且样本数目最多, 建议获得擦拭物后宜于3 d内提取(图1)。

图1 指纹DNA（采用植绒棉签擦拭转移）随时间以King Fisher法提取的结果分析Fig.1 The analysis of DNA changing along with time when the relevant fingerprint substances transferred by flocked swab were preserved for the DNA extraction with King Fisher method

3.3 五种方法提取指纹DNA的结果分析

如图2所示, STR基因座检出百分比≥ 60 %时, King Fisher法的样本检出数目最多, 为14个, Qiagen次之, 12个, Automate 8个, Chelex-100为6个, Maxwell 4个。STR基因座检出百分比≥ 90 %时, Qiagen样本数目检出最多, 9个, King Fisher法次之, 7个, Automate 6个, Chelex-100是4个, Maxwell 1个。亦即, King Fisher法的STR基因座检出百分比≥ 60 %时其DNA提取能力最高, 而≥ 90 %时其提取能力不及Qiagen法。性别差异对STR基因座的检出无影响。

图2 5种DNA提取方法样本数分布图Fig.2 The quantity distribution of the detected STR loci from fingerprint DNA extracted with 5 methods

3.4 案件不同客体上提取的检材STR基因座数目以及DNA定量分析

有时, 现场指纹不够清晰难以鉴定, 但其上可能残留有脱落细胞[17]。这些脱落细胞中的DNA（即接触性DNA）就可作为证据。但因这些接触性DNA含量少, 故在处理样本时需特别小心, 要尽量避免出现DNA的二次转移[18]。在实际案件中, 需要探讨DNA模板量阈值在多少ng时方可使STR基因座数目全部检出, 以及STR基因座数目与DNA模板量的关系。由表4可知, 检材A, 把手的指纹擦拭处基因座全部检出, 且图谱均一, DNA模板量最低为0.048 ng, rfu值≥ 1000; 检材B, 衣物的指纹擦拭处基因座全部检出, 且图谱均一, DNA模板量最低为0.054 ng, rfu值≥ 1500; 检材C, 衣物的指纹擦拭处基因座全部检出, 且图谱均一, DNA模板量最低为0.086 ng, rfu值≥ 2000; 检材D, 衣物的指纹擦拭处基因座数目全部检出, 且图谱均一, DNA模板量最低为0.015 ng, rfu值在100~1300之间。综上, DNA模板量≥ 0.010 ng时的STR基因座检出百分比≥ 60 %, 而且随着DNA模板量的增加, rfu值也呈上升趋势, STR图谱均一或虽混合但效果良好; 相反, 若DNA模板量< 0.010 ng, 则STR基因座检出百分比< 60 %, 且会出现非特异峰和混合杂乱图谱, STR基因座检出百分比≥ 90 %的概率基本为零。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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