取广玉兰叶片样品, 切片成约8mm× 8mm, 以10%乙醇溶液清洗, 再用去离子水漂洗, 自然晾干, 样品下表皮进行环境扫描电镜(ESEM)的形态观察、拍照, 在各种不同倍率下观察气孔器的分布、形态和密度, 在400倍率下进行形态的直接比对分析, 并进行纵径、横径和孔径的测量, 进行统计学分析。

取广玉兰、黄杨和狗牙根叶片样品若干, 在自然光照状态(春季)下分别静置1d、3d、7d后观察。切片成约8mm× 8mm, 以10%乙醇溶液清洗, 再用去离子水漂洗, 自然晾干, 样品下表皮进行环境扫描电镜(ESEM)的形态观察、拍照, 在300倍率下观察气孔器的分布和密度, 在500倍率下进行纵径、横径和孔径的测量, 在1000倍率下进行气孔形态的观察, 并对数据进行统计学分析。

取广玉兰、黄杨及狗牙根叶片样品3片, 模拟上海地区酸碱性土壤环境^[17], 分别在酸性(稀盐酸配制, pH约为6)、中性、碱性(氢氧化钠配制, pH约为8)溶液中浸泡12h后取出。切片成约8mm× 8mm, 以10%乙醇溶液清洗, 再用去离子水漂洗, 自然晾干, 样品下表皮进行环境扫描电镜(ESEM)的形态观察、拍照, 在300倍率下观察气孔器的分布和密度, 在500倍率下进行纵径、横径和孔径的测量。

不同种类叶片气孔器在气孔器密度、形状、大小及排列上会有所不同。通常来说, 植物亲缘关系越近, 其气孔器形态特征就越近, 反之形态差别就很大^[18]。

利用ESEM对广玉兰、黄杨及狗牙根的气孔器进行分析后发现, 3种植物叶片气孔器无论在密度、排列, 还是在形状、大小上均有差异(见图1, 图2)。

图1

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	图1 植物叶片气孔器扫描电镜照片(1000X)

图2

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	图2 植物叶片气孔器扫描电镜照片(300X)

分别在上海地区6个不同地点(虹口区曲阳公园, 徐汇区上海植物园, 黄浦区人民公园, 宝山区大华行知公园, 长宁区中山公园, 普陀区清涧公园)提取广玉兰叶片, 进行ESEM微观形态观察并进行纵径、横径和孔径的测量分析。广玉兰叶片上气孔器纵径、横径和孔径数值非常稳定。6个地点分别提取的叶片在上述数值上亦无明显区分, 稳定性非常好。

表1

表1

表1 不同地区广玉兰叶片气孔器纵径、横径及孔径(n=6) 标本 地点 纵径(μ m) 横径(μ m) 纵径/横径 孔径(μ m) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 曲阳 公园 28.20± 0.42 1.49 27.00± 0.30 1.11 1.04± 0.01 0.96 8.60± 0.17 1.98 上海 植物园 28.10± 0.37 1.32 27.10± 0.29 1.07 1.04± 0.01 0.96 8.5± 0.17 2.00 人民 公园 27.50± 0.29 1.05 26.60± 0.38 1.43 1.03± 0.01 0.97 7.90± 0.49 6.20 大华行 知公园 28.70± 0.35 1.22 27.10± 0.39 1.44 1.05± 0.01 0.95 8.50± 0.37 4.35 中山 公园 28.00± 0.41 1.46 26.50± 0.36 1.36 1.05± 0.01 0.95 7.10± 0.25 3.52 清涧 公园 27.70± 0.52 1.88 26.90± 0.49 1.82 1.03± 0.01 0.98 7.60± 0.47 6.18

表1 不同地区广玉兰叶片气孔器纵径、横径及孔径(n=6)

在模拟自然光照及风干条件后可以发现, 随时间推移, 不同种植物(以广玉兰、黄杨、狗牙根为例)叶片变化情况不一。广玉兰、黄杨在一定时间内(7d)相对较稳定, 气孔器的分布、密度及基本形态差异并不明显, 但随时间推移, 部分气孔器发生破坏, 其他未破坏气孔器的孔径也会变小(见表2, 表3)。而对于以狗牙根在很短时间(1d)内叶片细胞就会大量失水, 使得叶片皱缩严重, 气孔器难以观察。

在一定时间内(12h)中性溶液浸泡环境中植物(以广玉兰、黄杨、狗牙根为例)叶片气孔器的分布、密度、形态与正常叶片均无明显差异。乔灌木植物叶片(以广玉兰、黄杨为例)在弱酸碱性环境中气孔器形态均相对稳定(见图3, 图4)。草本植物叶片(以狗牙根为例)碱性溶液(pH约为8)浸泡环境下可以观察到细胞略有皱缩。而在酸性环境(pH约为6)中植物叶片细胞破坏严重, 气孔器难以观察(见图5)。

表2

表2

表2 广玉兰叶片自然风干条件下气孔器纵径、横径及孔径(n=6) 叶片 气孔器 0d 1d 3d 7d 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 纵径 (μ m) 27.92± 0.88 3.15 29.15± 1.16 3.97 28.97± 0.63 2.18 29.25± 0.68 2.32 横径 (μ m) 27.10± 1.07 3.94 27.43± 1.07 3.89 27.37± 1.13 4.14 27.67± 1.13 4.10 纵径/ 横径 1.03± 0.05 5.31 1.06± 0.05 4.80 1.06± 0.05 4.46 1.06± 0.04 3.31 孔径 (μ m) 6.02± 0.57 9.39 6.90± 0.32 4.71 6.74± 0.61 9.02 4.93± 0.53 10.84

表2 广玉兰叶片自然风干条件下气孔器纵径、横径及孔径(n=6)

表3

表3

表3 黄杨叶片自然风干条件下气孔器纵径、横径及孔径(n=6) 叶片 气孔器 0d 1d 3d 7d 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 均值 RSD (%) 纵径 (μ m) 37.92± 2.72 7.19 38.85± 1.09 2.80 36.18± 1.62 4.47 38.08± 3.49 8.96 横径 (μ m) 28.55± 1.83 6.42 28.50± 0.76 2.66 27.20± 1.30 4.77 28.45± 2.13 7.50 纵径/ 横径 1.33± 0.05 3.52 1.36± 0.05 3.90 1.33± 0.09 6.48 1.34± 0.06 4.34 孔径 (μ m) 15.18± 1.72 11.32 16.07± 1.68 10.44 11.13± 0.64 5.78 11.83± 2.19 18.48

表3 黄杨叶片自然风干条件下气孔器纵径、横径及孔径(n=6)

图3

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	图3 溶液浸泡12h后广玉兰样本叶片气孔器扫描电镜照片(300X)

图4

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	图4 溶液浸泡12h后黄杨样本叶片气孔器扫描电镜照片(300X)

图5

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	图5 溶液浸泡12h后狗牙根样本叶片气孔器扫描电镜照片(300X)

普通扫描电镜的样品室和镜筒内均为高真空(约为10^-6个大气压), 只能检验导电导热或经导电处理的干燥固体样品。低真空扫描电镜可直接检验非导电导热样品, 无需进行处理, 但是低真空状态下只能获得背散射电子像。 环境扫描电镜除具有以上两种电镜的所有功能外, 样品室内的气压可大于水在常温下的饱和蒸汽压, 对于生物样品、含水样品、含油样品, 既不需要脱水, 也不必进行导电处理, 可在自然的状态下直接观察二次电子图像, 更加有利于植物叶片上气孔器的观察。

基于实验数据分析, 利用环境扫描电镜观察植物叶片气孔器的分布、密度、形态等特征均稳定可靠。本文选取了上海地区绿化常见的3种植物, 广玉兰(乔木)、黄杨(灌木)及狗牙根(草坪植物)作为研究对象。发现不同种类植物叶片的气孔器的分布、密度、形态存在明显差异, 纵径、横径、纵径/横径比值、孔径等各项数值也存在差异, 这对于法庭科学领域通过观察植物叶片对植物进行分类学研究具有重要的参考价值。

在考察地域因素后可以发现, 对于生长在一定区域内的不同地区(上海市区范围)的同种植物(以广玉兰为例), 其植物叶片的气孔器的分布、密度、形态均无明显差异, 纵径、横径、纵径/横径比值、孔径等各项数值也相对稳定。这也保证了法庭科学领域植物叶片类型的微量物证检验的科学性和可靠性。

在模拟自然光照及风干条件后可以发现, 随时间推移, 不同种植物(以广玉兰、黄杨、狗牙根为例)叶片变化情况不一。乔木及灌木的植物叶片(以广玉兰、黄杨为例)在一定时间内(7d)相对较稳定, 气孔器的分布、密度及基本形态差异并不明显, 但随时间推移, 部分气孔器发生破坏, 其他未破坏气孔器的孔径也会变小。但在根据气孔器特征对不同种植物叶片的鉴别应用上影响不大。而对于草坪植物(以狗牙根为例)在很短时间(1d)内叶片细胞就会大量失水, 使得叶片皱缩严重, 气孔器难以观察。通过对该实验数据的分析, 提示法庭科学领域植物叶片类型的微量物证检验应考虑时间推移的影响, 通过进一步数据积累和统计分析, 对犯罪行为发生时间的推断可能也会有一定的借鉴意义。

通过模拟自然界可能存在的弱酸碱环境以及在水中浸泡等条件, 尝试分析气孔器发生的某些变化, 发现在一定时间内(12h)经水(中性, pH=7)浸泡后广玉兰、黄杨、狗牙根叶片的气孔器的分布、密度、形态均无明显差异, 纵径、横径、纵径/横径比值、孔径等各项数值也相对稳定。而通过对比弱酸碱性条件下气孔器形态特征的变化, 发现乔木及灌木的植物叶片(以广玉兰、黄杨为例)的气孔器形态特征都相对稳定。而对于草本植物(以狗牙根为例)叶片的气孔器特征在弱碱性环境中仍较明显, 在弱酸性环境中植物叶片细胞破坏严重, 气孔器难以观察。通过对该实验数据的分析, 提示法庭科学领域植物叶片类型的微量物证检验也应考虑周边环境的影响, 通过进一步数据积累和统计分析, 对犯罪行为发生地点的推断可能也会有一定的借鉴意义。

2008年某月, 某新村机耕地路边发生一起故意杀人案, 被害人吴某某的尸体被发现在路边菜地里。经侦查, 犯罪嫌疑人很快明确, 被害人吴某某的邻居吴某有重大作案嫌疑, 其在用石块将被害人吴某某伤害致死后, 回家将作案时所穿的衣物全部清洗, 而且犯罪现场为一片菜地, 难以找到与犯罪嫌疑人吴某相关联的犯罪证据。经过搜寻, 民警在犯罪嫌疑人吴某家中提取到鞋子一双, 怀疑为作案时所穿。该鞋子存在少量附着泥土和一片残缺的疑似植物叶片(长、宽均约0.3cm), 经过分析, 该鞋子上泥土量极少, 而犯罪现场和犯罪嫌疑人所住村庄的地面泥土又均无明显特征, 无法有效区分, 检验重点遂放在该残缺的植物叶片上。

在与犯罪现场菜地提取的青菜、鸡毛菜以及地表杂草作显微对比后, 发现该植物残片与青菜叶片、鸡毛菜叶片表面形态均有明显区别, 与地表杂草相似。经过扫描电镜检验, 发现该植物残余叶片与现场死者东侧地面植被叶片叶脉顶端特征、叶缘绒毛分布特征均相同, 叶缘绒毛尺寸相近, 叶片表面气孔分布特征以及气孔大小、形状均相同, 这些证据为最终案件定性起到了相当重要的作用。

本研究以植物叶片微观形态中的气孔器作为切入点, 对于植物叶片物证的检验鉴定工作提供了新的思路, 为明确犯罪现场, 完善证据链条等起到了重要作用。但由于本实验对象植物种类较少, 采集地区比较单一, 考察变化因素不够丰富, 故存在一定的局限性。然而通过本研究, 可以发现对于常见乔灌木的植物叶片其气孔器分布、密度、形态在较长时间内都保持相对稳定, 且随环境变化不大; 而草本植物的植物叶片因较易被破坏, 因注意相关物证的时效性。随着实验方法的不断完善和实验数据的大量积累, 相信基于气孔器观察的综合分析在法庭科学领域的植物叶片类型的微量物证检验中必定会发挥重要作用。